Metabolity immunōmodulujące sōm kluczowōm cychōm mikrostrzodowiska nowotworu (TME), ale z porōma wyjōntkami jejich tożsamości ôstowajōm w srogij miarze niyznōme. Tukej przeanalizowali my nowotwory i kōmōrki T z nowotworōw i ascytu pacjyntōw z wysokigo stopnia karcynōmōm płynnōm (HGSC), coby ujawnić metabōlōm tych roztōmajtych przedziałōw TME. Ascyta i kōmōrki nowotworowe majōm sroge rōżnice miyndzy metabolitami. W porōwnaniu z ascytōm, kōmōrki T, kere infiltrujōm nowotwōr, sōm znaczōnco zbogacōne w 1-metylnikōtynamid (MNA). Chocioż poziōm MNA w kōmōrkach T je zwiynkszōny, ekspresyjo nikotynamidowyj N-metyltransferazy (ynzymu, kery katalizuje transfer grup metylowych z S-adenozylmetioniny do nikotynamidu) je ôgraniczōno do fibroblastōw i kōmōrek nowotworowych. Funkcjōnalnie MNA indukuje kōmōrki T do wydzielanio cytokiny prōmujōncyj nowotwōr, czynnik nekrozy nowotworu alfa. Beztōż MNA pochodzōnce z TME prziczynio sie do immunologicznyj regulacyje kōmōrek T i reprezyntuje potyncjalny cyl immunoterapije do lyczynio ludzkigo raka.
Metabolity pochodzōnce z guzōw mogōm mieć głymboki wpływ hamowczy na ôdporność przeciwguzkowo, a coroz wiyncyj dowodōw pokozuje, iże mogōm tyż sużyć za kluczowo siyła napōmniyniowo progresji choroby (1). Ôkrōm efektu Warburga, ôstatnie roboty zaczły karakteryzować stan metaboliczny kōmōrek nowotworowych i jego zwiōnzek ze stanym immunologicznym mikrostrzodowiska nowotworowego (TME). Badania nad mysimi modelami i ludzkimi kōmōrkami T wykozały, iże metabolizm glutaminy (2), metabolizm oksydacyjny (3) i metabolizm glukozy (4) mogōm działać niyznoleżnie na roztōmajte podgrupy kōmōrek ôdpornościowych. Pora metabolitōw na tych sztrekach hamowo przeciwnowotworowo funkcyjo kōmōrek T. Dowiedziōno, iże blokada koynzymu tetrahydrobiopteryny (BH4) może uszkodzić proliferacyjo kōmōrek T, a wzrōst BH4 w ôrganizmie może zwiynkszyć przeciwguzkowo immunologiczno ôdpowiydź pośredniczōno bez CD4 i CD8. Ôkrōm tego immunosupresyjny efekt kynureniny może być uratowany bez podanie BH4 (5). W zmutowanym glioblastōmie izocytranowo dehydrogenazy (IDH) wydzielanie enancjometabolicznego (R)-2-hydroksyglutaranianu (R-2-HG) hamowo aktywacyjo kōmōrek T, proliferacyjo i aktywność cytolizy (6). Ôstatnio wykozano, iże metylglioksal, produkt uboczny glikozy, je produkowany bez kōmōrki supresorowe pochodzynio mieloidalnego, a transfer metylglioksalu bez kōmōrki T może hamować funkcyjo kōmōrek T efektorowych. W lyczyniu neutralizacyjo metylglioksalu może przezwyciynżyć aktywność kōmōrek supresorowych pochodzōncych z mieloidōw (MDSC) i synergicznie zwiynkszyć terapijo blokady pōnktōw kōntrolnych u mysich modelōw (7). Te badania zbiorowo podkryślajōm kluczowo rola metabolitōw pochodzōncych z TME w sztalowaniu funkcyje i aktywności kōmōrek T.
Dysfunkcyjo kōmōrek T była szyroko ôdnotowano w raku jajnikōw (8). Je to czynściowo sprawiōne cychami metabolicznymi niyôdłōncznymi ôd hipoksyje i niyôbyczajnych naczyń nowotworowych (9), co skutkuje kōnwersyjōm glukozy i tryptofanu w produkty uboczne, take jak kwas mlekowy i kynurenina. Nadbytek mlyczanu pozakōmōrkowego zmyńszo produkcyjo interferōnu-γ (IFN-γ) i napyndza rōżnicowanie mielosupresyjnych podgrup (10, 11). Spożycie tryptofanu bezpostrzednio hamowo proliferacyjo kōmōrek T i hamowo sygnalizacyjo receptōrōw kōmōrek T (12-14). Mimo tych ôbserwacyji, moc roboty naôbkoło immunologicznego metabolizmu było przekludzōnych w chowaniu kōmōrek T in vitro ze użyciym zoptymalizowanych mediōw abo ôgraniczōnych do hōmologicznych mysich modelōw in vivo, z kerych żodyn niy ôdzwierciedlo w połni heterogyniczności ludzkich nowotworōw jak tyż fizjologicznego strzodowiska makro i mikro.
Czynstym cychōm raka jajnikōw je rozprzestrzynianie sie ôbrzmiynnym i ukŏzanie sie ascytu. Akumulacyjo płynu kōmōrkowego we ascycie wiōnże sie z zaawansowanōm chorobōm i słabym prognozōm (15). Podle doniesiyń, tyn unikatowny przedzioł je hipoksyczny, mo wysoki poziōm czynnika wzrōstu yndotelialnego naczyniowego (VEGF) i indoleaminowo 2,3-dioksygenazy (IDO) i je infiltrowany bez kōmōrki T regulacyjne i kōmōrki hamowajōnce mieloidy (15-18). Strzodowisko metaboliczne ascytu może być inksze ôd strzodowiska samego tumoru, bezto reprogramowanie kōmōrek T w przestrzyństwie ôbrzmiynnym je niyklarowne. Ôkrōm tego kluczowe rōżnice i heterogyniczność miyndzy ascytōm a metabolitami ôbecnymi we strzodowisku nowotworu mogōm zawodzić infiltracyji kōmōrek ôdpornościowych i jejich funkcyji na nowotworach, tōż potrzebne sōm dalsze badania.
Coby rozwiōnzać te problymy, ôbrobiyli my metoda tandymowyj spektrōmetryje masowyj wrażliwyj separacyje kōmōrek i chrōmatografije ciekłych (LC-MS/MS) do badanio roztōmajtych zortōw kōmōrek (w tym kōmōrek T CD4 + i CD8 +), jak tyż we postrzodku i miyndzy nowotworami. Jeji metabolity ôbyjmujōm kōmōrki w tym samym strzodowisku ascytu i nowotworu pacjynta. Używōmy tyj metody we połōnczyniu z wysokowymiarowōm cytōmetryjōm przepływu i sekwyncjōnowaniym jednokōmōrkowego RNA (scRNA-seq), coby zapewnić wysoko rozwiōnzany portret statusu metabolicznego tych kluczowych populacyjōw. Ta metoda wykozała znaczōncy wzrōst poziōmu 1-metylnikotynamidu (MNA) w kōmōrkach T nowotworowych, a eksperymynta in vitro wykozały, iże immunōmodulujący wpływ MNA na funkcyjo kōmōrek T bōł wczasnij niyznōmy. Ôgōlnie rzecz bierōnc, ta metoda ujawnio wzajymne interakcyje metaboliczne miyndzy nowotworami a kōmōrkami ôdpornościowymi i dostarczo unikalnych wglōndōw na metabolity regulacyje ôdpornościowyj, kere mogōm być przidajne do lyczynio immunoterapije raka jajnikōw ôpartyj na kōmōrkach T Możliwości lyczynio.
Użyli my wysokowymiarowyj cytōmetryje przepływu do jednoczesnego ôkryślynio pochłōnianio glukozy [2-(N-(7-nitrofenyl-2-oksa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-dezoksyglukozy (2-NBDG) i aktywności mitochōndrialnyj [MitoTracker Deep Red, DR01) sōm typowe markery, kere wyrōżniajōm kōmōrki ôdpornościowe i populacyje kōmōrek nowotworowych (Tabula S2 i Figura S1A). Ta analiza wykozała, iże w porōwnaniu z kōmōrkami T, ascyta i kōmōrki nowotworowe majōm srogszy poziōm pochłōnianio glukozy, ale majōm myńsze rōżnice w aktywności mitochōndrialnyj. Strzednie pochłōnianie glukozy bez kōmōrek nowotworowych [CD45-EpCAM (EpCAM)+] wynosi trzi do sztyro razy srogsze aniżeli pochłōnianie glukozy bez kōmōrek T, a strzednie pochłōnianie glukozy bez kōmōrek CD4 + T wynosi 1,2 razy srogsze aniżeli bez kōmōrek CD8 + T, co wskozuje na to, iże limfocyty infiltrujōnce nowotworowe w limfocytach tumorowych wymogajōm roztōmajtych TME). W przeciwiyństwie do tego, aktywność mitochōndrialno w kōmōrkach nowotworowych je podobno do aktywności kōmōrek CD4 + T, a aktywność mitochōndrialno ôbōch zortōw kōmōrek je srogszo aniżeli aktywność kōmōrek CD8 + T (Figura 1B). Ôgōlnie rzecz bierōnc, te wyniki pokozujōm poziōm metabolizmu. Aktywność metaboliczno kōmōrek nowotworowych je srogszo aniżeli aktywność kōmōrek CD4 + T, a aktywność metaboliczno kōmōrek CD4 + T je srogszo aniżeli aktywność kōmōrek CD8 + T. Mimo tych skutkōw w roztōmajtych zortach kōmōrek, niy ma stałyj rōżnice we stanie metabolicznym kōmōrek T CD4 + i CD8 + ani jejich wzglyndnych proporcyjach we ascycie w porōwnaniu z nowotworami (Figura 1C). W przeciwiyństwie do tego, we frakcyji kōmōrek CD45 udzioł kōmōrek EpCAM+ w nowotworze wzrōs w porōwnaniu z ascytōm (Figura 1D). Zaôbserwowali my tyż klarowno rōżnica metaboliczno miyndzy skłodnikami kōmōrek EpCAM+ i EpCAM-. Kōmōrki EpCAM+ (nowotworowe) majōm srogsze pochłōnianie glukozy i aktywność mitochōndrialno aniżeli kōmōrki EpCAM-, co je moc srogsze aniżeli aktywność metaboliczno fibroblastōw w kōmōrkach nowotworowych w TME (Figura 1, E i F).
(A i B) Strzednio intynsywność fluorescyncyje (MFI) pochłōnianio glukozy (2-NBDG) (A) i aktywność mitochōndrialno kōmōrek CD4 + T (MitoTracker ćmawo czerwōno) (B) Reprezentatywne wykresy (po lewyj) i dane tabulowe (po prawyj), kōmōrek CD8 + T i kōmōrek nowotworowych i EpCAM + CD45-. (C) Stosunek kōmōrek CD4 + i CD8 + (kōmōrek CD3 + T) we ascycie i nowotworze. (D) Udzioł kōmōrek nowotworowych EpCAM + we ascycie i nowotworze (CD45-). (E i F) Pochłōnianie glukozy EpCAM + CD45-nowotworu i EpCAM-CD45-maciyrze (2-NBDG) (E) i aktywność mitochōndrialno (MitoTracker ćmawo czerwōno) (F) reprezyntatywne wykresy (po lewyj) i dane tabulowe (po prawyj) Ascyta i kōmōrki nowotworowe. (G) Reprezentatywne wykresy ekspresyje CD25, CD137 i PD1 bez cytōmetryjo przepływu. (H i I) Ekspresyjo CD25, CD137 i PD1 na kōmōrkach CD4 + T (H) i CD8 + T (I). (J i K) Fynotypy najiwnych, pamiyńci cyntralnyj (Tcm), efektorowyj (Teff) i pamiyńci efektorowyj (Tem) ôparte na ekspresyji CCR7 i CD45RO. Reprezentatywne ôbrazy (po lewyj) i dane tabulowe (po prawyj) kōmōrek CD4 + T (J) i kōmōrek CD8 + T (K) w ascycie i nowotworach. Werty P ôkryślōne bez dwojisty test t (*P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). Lynijo reprezyntuje sztimujōncych pacjyntōw (n = 6). FMO, fluorescyncyjo minus jedyn; MFI, postrzednio intynsywność fluorescyncyje.
Dalszo analiza wykozała inksze znaczōnce rōżnice miyndzy wysoko rozwiōnzanym statusym fynotypowym kōmōrek T. Aktywowano (Figura 1, G do I) i pamiyńć efektorowo (Figura 1, J i K) w nowotworach sōm moc czyńściyjsze aniżeli ascyta (proporcyjo kōmōrek CD3 + T). Podanie, analiza fynotypu bez ekspresyjo markerōw aktywacyje (CD25 i CD137) i markerōw deplycyje [biōłtko zaprogramowanego śmierci kōmōrkowyj 1 (PD1)] wykozała, iże chocioż cychy metaboliczne tych populacyjōw sōm inksze (Figura S1, B do E) , Ale żodne znaczōnce rōżnice metaboliczne miyndzy efektym pamiyńciowōm abo ôbserwowano było kōnsekwyntnie (Figura S1). F do I). Te wyniki były potwierdzōne bez użycie metod maszinowego uczynio sie do autōmatycznego przipisowanio fynotypōw kōmōrkowych (21), co dalij pokozało ôbecność srogij liczby kōmōrek szkeletu kostnego (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) we ascycie ôd pacjynta (Figura S2A ). Postrzōd wszyskich zidyntyfikowanych zortōw kōmōrek ta populacyjo kōmōrek mieloidalnych wykozała nojwyższe pochłōnianie glukozy i aktywność mitochōndrialno (Figura S2, B do G). Te wyniki podkryślajōm mocne rōżnice metaboliczne miyndzy mocōm zortōw kōmōrek wystympujōncych w ascycie i nowotworach u pacjyntōw z HGSC.
Głōwnym wyzwaniym w zrozumiyniu cych metabonōmicznych TIL je potrzeba wyizolowanio prōbek kōmōrek T ô stykajōncyj czystości, jakości i wielości z nowotworōw. Ôstatnie badania wykozały, iże metody zortowanio i zbogacanio koralikōw ôparte na cytōmetryji przepływowyj mogōm kludzić do zmian w profilach metabolitōw kōmōrkowych (22-24). Coby przezwyciynżyć tyn problym, zoptymalizowali my metoda zbogacynio koralikōw, coby wyizolować i wyizolować TIL z chirurgicznie wyresektowanego ludzkigo raka jajnikōw przed analizōm ze pōmocōm LC-MS/MS (patrz Materyje i Metody; Figura 2A). Coby ôcynić ôgōlny wpływ tego protokołu na zmiany metabolitōw, porōwnowali my profile metabolitōw kōmōrek T aktywowanych bez zdrowych dowcōw po powyższym kroku separacyje koralikōw z kōmōrkami, kere niy były rozdzielōne koralikami, ale ôstały na lodzie. Ta analiza kōntrole jakości wykozała, iże miyndzy tymi dwōma warōnkami je wysoko korelacyjo (r = 0,77), a techniczno powtorzalność grupy 86 metabolitōw mo wysoko powtorzalność (Figura 2B). Bezto te metody mogōm przekludzać akuratno analiza metabolitōw w kōmōrkach, kere przechodzōm zbogacynie zorty kōmōrkowyj, zapewniajōnc tōż piyrszo platforma we wysokij rozdzielczości do idyntyfikacyje specyficznych metabolitōw w HGSC, co przizwolo ludziōm na głymbsze zrozumiynie specyficzności kōmōrkowyj Programu metabolizmu seksualnego.
(A) Schematyczny diagram zbogacynio magnetycznych koralikōw. Przed analizōm ze pōmocōm LC-MS/MS kōmōrki przejdōm trzi dalsze cykle zbogacynio magnetycznych koralikōw abo ôstanōm na lodzie. (B) Wpływ zorty zbogacynio na hojność metabolitōw. Strzednio trzech mior dlo kożdyj zorty zbogacynio ± SE. Szaro linijo reprezyntuje relacyjo 1:1. Korelacyjo we postrzodku klasy (ICC) powtarzajōncych sie pōmior pokozano na etykecie aksy. NAD, dynukleotyd nikotynamidu adyniny. (C) Schematyczny diagram przepływu roboty analizy metabolitōw pacjynta. Ascyta abo nowotwory sōm zebrane ôd pacjyntōw i kriokonserwowane. Niywielgo tajla kożdyj prōbki była analizowano ze pōmocōm cytōmetryje przepływowyj, w czasie kej pozostałe prōbki przeszły trzi cykle zbogacynio kōmōrek CD4+, CD8+ i CD45-. Te frakcyje kōmōrkowe były analizowane ze użyciym LC-MS/MS. (D) Karta ciepła standaryzowanyj hojności metabolitōw. Dendrogram reprezyntuje skupiynie ôd Warda euklidesowych ôdległości miyndzy prōbkami. (E) Analiza głōwnych skłodnikōw (PCA) karty metabolitōw prōbkowyj, pokozujōnco trzi repliki kożdyj prōbki, prōbki ôd tego samego pacjynta sōm połōnczōne linijōm. (F) PCA profilu metabolitōw prōbki warōnkowanyj na pacjynta (to znaczy ze użyciym czynściowyj redundancyje); zorta prōbki je ôgraniczōno bez wypukły kadłub. PC1, głōwny skłodnik 1; PC2, głōwny elymynt 2.
Dalij zastosowali my ta metoda zbogacynio do analizy 99 metabolitōw we frakcyjach kōmōrek CD4 +, CD8 + i CD45 w piyrwotnych ascytach i nowotworach sześciu pacjyntōw z HGSC (Figura 2C, Figura S3A i Tabulka S3 i S4). Populacyjo, co nos interesuje, stanowi ôd 2% do 70% ôryginalnyj srogij prōbki żywych kōmōrek, a udzioł kōmōrek je moc roztōmajty miyndzy pacjyntami. Po rozdzielyniu koralikōw zbogacōny ułōmek interesu (CD4+, CD8+ abo CD45-) stanowi strzednio wiyncyj jak 85% wszyskich żywych kōmōrek we prōbce. Ta metoda zbogacynio przizwolo nōm na analiza populacyji kōmōrek z ludzkich metabolizmu tkanek nowotworowych, co je niymożebne do wykōnanio ze srogich prōbek. Przi użyciu tego protokołu ustalili my, iże l-kinurenina i adenozyna, te dwa dobrze scharakteryzowane metabolity immunosupresyjne były zwiynkszōne w kōmōrkach T nowotworowych abo kōmōrkach nowotworowych (Figura S3, B i C). Beztōż te wyniki dymōnstrujōm wierność i zdolność naszyj technologije separacyje kōmōrek i spektrōmetryje masowyj do znojdowanio biologicznie wożnych metabolitōw we tkankach pacjyntōw.
Naszo analiza wykozała tyż siylne metaboliczne rozdzielynie zortōw kōmōrek we postrzodku i miyndzy pacjyntami (Figura 2D i Figura S4A). Nojbarzij w porōwnaniu z inkszymi pacjyntami, pacjynt 70 wykozoł roztōmajte cychy metaboliczne (Figura 2E i Figura S4B), co wskozuje na to, iże miyndzy pacjyntami może istnieć srogo heterogyniczność metaboliczno. Warto zauważyć, iże w porōwnaniu z inkszymi pacjyntami (1,2 do 2 litrōw; tabula S1), cołkowito wielość ascytu zebranyj u pacjynta 70 (80 ml) była myńszo. Kōntrola heterogyniczności miyndzypacjyntōm w czasie analizy głōwnych skłodnikōw (bez przikłod ze użyciym czynściowyj analizy redundancyje) wykazuje stałe zmiany miyndzy zortami kōmōrek, a zorty kōmōrek i/abo mikrostrzodowisko sōm klarownie agregowane zgodnie z profilym metabolitōw (Figura 2F ). Analiza pojedynczych metabolitōw podkryślyła te efekty i pokozała znaczōnce rōżnice miyndzy zortami kōmōrek a mikrostrzodowiskym. Warto zauważyć, iże nojbarzij ekstrymalnōm zaôbserwowanōm rōżnicōm je MNA, kere je zwykle zbogacōne w kōmōrki CD45- jak tyż w kōmōrki CD4+ i CD8+, kere infiltrujōm nowotwōr (Figura 3A). W przipadku kōmōrek CD4 + efekt tyn je nojbarzij ôczywisty, a MNA w kōmōrkach CD8 + tyż zdowo sie być pod mocnym wpływym strzodowiska. Niyma to ale ważne, pōniywoż ino trzi z sześciu pacjyntōw mogōm być ôcyniane pod wzglyndym wynikōw CD8+ nowotworu. Ôkrōm MNA, w roztōmajtych zortach kōmōrek w ascycie i nowotworach, inksze metabolity, kere sōm słabo skarakteryzowane w TIL, sōm tyż rōżnicowo bogate (Figurki S3 i S4). Beztōż te dane pokozujōm ôbiecujōncy zestow immunōmodulujących metabolitōw do dalszych podszukowań.
(A) Znormalizowano zawartość MNA w kōmōrkach CD4+, CD8+ i CD45- z ascytu i nowotworu. Box plot pokozuje mediana (lynijo), zasiyng miyndzykwartylowy (zarw rōmy) i zasiyng danych, do 1,5 razy srogszy zasiyng miyndzykwartylowy (wōnsy rōmy). Jak ôpisano w Materyjach i metodach ôd pacjynta, użyj wertu limma ôd pacjynta do ôkryślynio wertu P (*P<0,05 i **P<0,01). (B) Schematyczny diagram metabolizmu MNA (60). Metabolity: S-adynozylo-1-metionina; SAH, S-adynozyna-1-hōmocysteina; NA, nikotynamid; MNA, 1-metylnikōtynamid; 2-PY, 1-metyl- 2-piridōn-5-karboksamid; 4-PY, 1-metyl-4-piridōn-5-karboksamid; NR, nikotynamidowo ryboza; NMN, mōnonukleotyd nikotynamidu. Ynzymy (zielōne): NNMT, nikotynamidowo N-metyltransferaza; SIRT, siyrtuiny; NAMPT, nikotynamidowo fosforybozylotransferaza; AOX1, aldehydowoksydaza 1; NRK, kinaza rybozydōw nikotynamidu; NMNAT, nikotynamidowo mononukleotydowo transferaza adenilanowo; Pnp1, fosforylaza nukleozydōw purynōw. (C) t-SNE scRNA-seq ascyty (szare) i nowotworu (czerwōny; n = 3 pacjyntōw). (D) Ekspresyjo NNMT w roztōmajtych populacyjach kōmōrek zidyntyfikowanych ze pōmocōm scRNA-seq. (E) Ekspresyjo NNMT i AOX1 w SK-OV-3, ludzkij ymbriōnalnyj nerce (HEK) 293T, kōmōrkach T i kōmōrkach T lyczōnych MNA. Złożōno ekspresyjo je pokozano wzglyndym SK-OV-3. Pokazany je muster ekspresyje ze SEM (n = 6 zdrowych dowcōw). Werty Ct srogsze ôd 35 sōm uwożane za niywykrywalne (UD). (F) Ekspresyjo SLC22A1 i SLC22A2 w kōmōrkach SK-OV-3, HEK293T i kōmōrkach T lyczōnych 8mM MNA. Złożōno ekspresyjo je pokozano wzglyndym SK-OV-3. Pokazany je muster ekspresyje ze SEM (n = 6 zdrowych dowcōw). Werty Ct srogsze ôd 35 sōm uwożane za niywykrywalne (UD). (G) Zawartość kōmōrkowego MNA w aktywowanych zdrowych kōmōrkach T dowcy po 72 godzinach inkubacyje z MNA. Pokazany je muster ekspresyje ze SEM (n = 4 zdrowych dowcōw).
MNA je produkowane bez przeniesiynie grupy metylowej ze S-adenozylo-1-metioniny (SAM) do nikotynamidu (NA) bez nikotynamidowo N-metyltransferaza (NNMT; figura 3B). NNMT je nadeksprymowane w roztōmajtych ludzkich nowotworach i wiōnże sie z proliferacyjōm, inwazyjōm i przerzutami (25-27). Coby lepij zrozumieć zdrzōdło MNA w kōmōrkach T w TME, użyli my scRNA-seq do skarakteryzowanio ekspresyje NNMT w roztōmajtych zortach kōmōrek w ascycie i nowotworach trzech pacjyntōw z HGSC (Tabula S5). Analiza kole 6 500 kōmōrek wykozała, iże we strzodowiskach ascytu i nowotworowych ekspresyjo NNMT była ôgraniczōno do dōmniymanych populacyjōw fibroblastōw i kōmōrek nowotworowych (Figura 3, C i D). Warto zauważyć, iże niy ma ôczywistyj ekspresyje NNMT w żodnyj populacyji, kero eksprymuje PTPRC (CD45 +) (Figura 3D i Figura S5A), co wskozuje na to, iże MNA wykryte we widmie metabolitōw było wkludzōne do kōmōrek T. Ekspresyjo aldehydowyj oksydazy 1 (AOX1) przekształco MNA w 1-metyl-2-piridōn-5-karboksamid (2-PYR) abo 1-metyl-4-piridōn-5-karboksamid (4- PYR); Figura 3B) je tyż ôgraniczōno do populacyje fibroblastōw eksprymujōncych COL1A1 (Figura S5A), co razym wskazujōm, iże kōmōrki T niy majōm zdolności do kōnwyncjōnalnego metabolizmu MNA. Muster ekspresyje tych gynōw zwiōnzanych z MNA bōł zweryfikowany ze użyciym drugigo niyznoleżnego zestawu danych kōmōrkowych z ascytu ôd pacjyntōw z HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Ôkrōm tego, wielościowo analiza ryakcyje lyńcuchowyj polimerazy (qPCR) zdrowych kōmōrek T dowcy lyczōnych MNA pokozała, iże w porōwnaniu z kōntrolnymi kōmōrkami nowotworowymi jajnikōw SK-OV-3, NNMT abo AOX1 niy były bezma eksprymowane (Figura 3E). Te niyôczekowane wyniki wskazujōm, iże MNA może być wydzielane z fibroblastōw abo nowotworōw do sōmsiednich kōmōrek T w TME.
Chocioż kandydaty ôbyjmujōm familijo ôrganicznych transporterōw katyōnōw ôd 1 do 3 (OCT1, OCT2 i OCT3) kodowanych bez familijo rozpuszczalnych nosicieli 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 i SLC22A3), potyncjalne transportery MNA sōm durch niyôkryślōne (28) . QPCR mRNA ze zdrowych kōmōrek T dowcy wykozało niski poziōm ekspresyje SLC22A1, ale niywykrywalny poziōm SLC22A2, co potwierdziyło, iże było wczasnij ôgłoszōne w literaturze (Figura 3F) (29). W przeciwiyństwie do tego, linijo kōmōrkowo nowotworu jajnika SK-OV-3 eksprymowała wysoki poziōm ôbu transporterōw (Figura 3F).
Coby przebadać możliwość posiadanio zdolności kōmōrek T do wchłōnianio cudzego MNA, zdrowe kōmōrki T dowcy były chowane bez 72 godziny w ôbecności roztōmajtych stynżyń MNA. Przi braku egzogynicznego MNA niy idzie wykryć zawartości kōmōrkowyj MNA (Figura 3G). Jednak aktywowane kōmōrki T lyczōne egzogynicznym MNA wykozały znoleżny ôd dawki wzrōst zawartości MNA w kōmōrkach, do 6 mM MNA (Figura 3G). Tyn wynik wskazuje, iże pōmimo niskigo poziōmu ekspresyje transportera i braku głōwnego ynzymu zapowiedzialnego za wewnōntrzkōmōrkowy metabolizm MNA, TIL może durch przijmować MNA.
Widmo metabolitōw w kōmōrkach T ôd pacjyntōw i eksperymynta wchłōnianio MNA in vitro zwiynkszajōm możliwość, iże fibroblasty zwiōnzane z rakym (CAF) wydzielajōm MNA, a kōmōrki nowotworowe mogōm sztalować fynotyp i funkcyjo TIL. Coby ôkryślić wpływ MNA na kōmōrki T, zdrowe dowcy kōmōrki T były aktywowane in vitro w ôbecności abo braku MNA, a jejich proliferacyjo i produkcyjo cytokin były ôcyniane. Po 7 dniach przidowanio MNA w nojsrogszyj dawce liczba podwojyń populacyje była strzednio zmyńszōno, w czasie kej wigor bōł utrzimowany we wszyskich dawkach (Figura 4A). Ôkrōm tego lyczynie egzogynnym MNA sprawiyło wzrōst udziału kōmōrek T CD4 + i CD8 + eksprymujōncych czynnik nekrozy nowotworu-α (TNFα; figura 4B). W przeciwiyństwie do tego, produkcyjo wewnōntrzkōmōrkowo IFN-γ była znaczōnco zmyńszōno w kōmōrkach CD4 + T, ale niy w kōmōrkach CD8 + T, i niy było znaczōncyj pōmiany w interleukinach 2 (IL-2; figura 4, C i D). Beztōż test immunosorbentu połōnczōny z ynzymami (ELISA) supernatantōw z tych kultur kōmōrek T lyczōnych MNA wykozoł znaczōncy wzrōst TNFα, spod IFN-γ i brak zmiany IL-2 (Figura 4, E do G). . Spodku IFN-γ wskozuje, iże MNA może ôdgrywać rola w hamowaniu przeciwnowotworowyj aktywności kōmōrek T. Coby symulować wpływ MNA na cytotoksyczność pośredniczōno bez kōmōrki T, chimeryczne kōmōrki receptora antygynu T (FRα-CAR-T) cylujōnce w receptōr folianu α i CAR-T (GFP) sztalowane bez kōmōrki zielōnego fluorescyncyjnego biōłtka (GFP) -CAR-T) sōm produkowane bez zdrowe kōmōrki ôbwodowyj krwie dowcy ( mononuclear PBMC). Kōmōrki CAR-T były chowane bez 24 godziny w ôbecności MNA, a potym spōłkultywowane z ludzkimi kōmōrkami nowotworowymi jajnikōw SK-OV-3, co eksprymujōm receptōr folianu α we stosunku efektora do cylu 10:1. Ôbsuga MNA sprawiyła znaczōncy spadek zabijajōncyj aktywności kōmōrek FRα-CAR-T, co było podobne do kōmōrek FRα-CAR-T lyczōnych adenozynōm (Figura 4H).
(A) Cołko liczba żywych kōmōrek i podwojynie populacyje (PD) prosto z chowanio w dziyń 7. Słupkowe wykres reprezyntuje strzednio + SEM sześciu zdrowych dowcōw. Reprezyntuje dane z aby n = 3 niyznoleżnych eksperymyntōw. (B do D) CD3/CD28 i IL-2 były używane do aktywacyje kōmōrek T w jejich ôdpednich stynżyniach MNA bez 7 dni. Przed analizōm kōmōrki były stymulowane PMA/jōnōmycynōm ze GolgiStop bez 4 godziny. Ekspresyjo TNFα (B) w kōmōrkach T. Przikładowy ôbraz (po lewyj) i dane tabulowe (po prawyj) ekspresyje TNFα w żywych kōmōrkach. Ekspresyjo IFN-γ (C) i IL-2 (D) w kōmōrkach T. Ekspresyjo cytokin była mierzōno ze pōmocōm cytōmetryje przepływu. Słupkowy wykres reprezyntuje strzednio (n = 6 zdrowych dowcōw) + SEM. Do ôkryślynio wertu P użyj jednodrōżnyj analizy wariancyje i powtarzajōncych sie miar (*P<0,05 i **P<0,01). Reprezyntuje dane z aby n = 3 niyznoleżnych eksperymyntōw. (E do G) CD3/CD28 i IL-2 były używane do aktywacyje kōmōrek T w jejich ôdpednich stynżyniach MNA bez 7 dni. Medium było zebrane przed i po 4 godzinach stymulacyje PMA/jōnōmycynōm. Stynżynia TNFα (E), IFN-γ (F) i IL-2 (G) były mierzōne ze pōmocōm ELISA. Słupkowy wykres reprezyntuje strzednio (n = 5 zdrowych dowcōw) + SEM. Werta P ôkryślōno ze użyciym jednospōłczynnyj analizy wariancyje i powtarzajōncych sie pōmior (*P<0,05). Kropkowano linijo skazuje na granica wykrycio wykrycio. (H) Test lizy kōmōrek. Kōmōrki FRα-CAR-T abo GFP-CAR-T były regulowane ze pōmocōm adenozyny (250μM) abo MNA (10 mM) bez 24 godziny, abo ôstawiane bez lyczynio (Ctrl). Mierzōno było procyntowe zabijanie kōmōrek SK-OV-3. Werta P ôkryślōno bez test t Welcha (*P<0,5 i **P<0,01).
Coby mechanistyczne zrozumieć MNA-znoleżno regulacyjo ekspresyje TNFα, ôcyniynto zmiany w mRNA TNFα kōmōrek T lyczōnych MNA (Figura 5A). Zdrowe kōmōrki T dowcy lyczōne MNA wykozały dwukrotny wzrōst poziōmu transkrypcyje TNFα, co wskozuje na to, iże MNA je zoleżne ôd regulacyje transkrypcyje TNFα. Coby zbadać tyn możliwy mechanizm regulacyjny, dwa znane faktory transkrypcyjne, kere sztalujōm TNFα, mianowicie aktywowany czynnik jōndrowy kōmōrek T (NFAT) i specyficzne biōłtko 1 (Sp1), były ôcyniane w ôdpowiedzi na wiōnzanie MNA z proksymalnym prōmotorym TNFα ( 30 ). Prōmotōr TNFα zawiyro 6 zidyntyfikowanych miyjsc łōnczynio NFAT i 2 miyjsc łōnczynio Sp1, kere nakłodajōm sie w jednym miyjscu [-55 por prawideł (bp) z 5'cap] (30). Immunoprecypitacyjo chrōmatyny (ChIP) wykozała, iże przi lyczyniu MNA wiōnzanie Sp1 z prōmotorym TNFα wzrosło trzikrotnie. Włōnczynie NFAT tyż zwiynkszyło i zbliżyło sie do znaczynio (Figura 5B). Te dane skazujōm, iże MNA sztaluje ekspresyjo TNFα bez transkrypcyjo Sp1, a w myńszym stopniu ekspresyjo NFAT.
(A) W porōwnaniu z kōmōrkami T chowanymi bez MNA, zmiana ekspresyje TNFα w kōmōrkach T lyczōnych MNA. Pokazany je muster ekspresyje ze SEM (n = 5 zdrowych dowcōw). Reprezyntuje dane z aby n = 3 niyznoleżnych eksperymyntōw. (B) Prōmotōr TNFα kōmōrek T lyczōnych z abo bez 8 mM MNA po tym, jak NFAT i Sp1 były połōnczōne ze stymulacyjōm (Ctrl) i PMA/jōnōmycynōm bez 4 godziny. Immunoglobulina G (IgG) i H3 były używane ôdpednio za ujymne i pozytywne kōntrole dlo immunoprecypitacyje. Kwantyfikacyjo ChIP pokozała, iże wiōnzanie Sp1 i NFAT z prōmotorym TNFα w kōmōrkach lyczōnych MNA wzrosło pora razy w porōwnaniu z kōntrolōm. Reprezyntuje dane z aby n = 3 niyznoleżnych eksperymyntōw. Werta P ôkryślōno bez mocka testōw t (*** P <0,01). (C) W porōwnaniu z ascytōm HGSC, kōmōrki T (niycytotoksyczne) wykozały zwiynkszōno ekspresyjo TNF w nowotworze. Farby reprezyntujōm roztōmajtych pacjyntōw. Wykazowane kōmōrki były losowo pobrane do 300 i dźwigniynte, coby ôgraniczyć przerysowanie (** Padj = 0,0076). (D) Propōnowany model MNA dlo raka jajnikōw. MNA je produkowane w kōmōrkach nowotworowych i fibroblastach w TME i je przijmowane bez kōmōrki T. MNA zwiynkszo wiōnzanie Sp1 z prōmotorym TNFα, co prowadzi do zwiynkszōnyj transkrypcyje TNFα i produkcyje cytokin TNFα. MNA tyż powoduje spadek IFN-γ. Hamowanie funkcyje kōmōrek T prowadzi do zmyńszōnyj zdolności do zabijanio i przispiyszonego wzrōstu nowotworu.
Podle doniesiyń TNFα mo znoleżne ôd przodnij i zadku przeciwnowotworowe i przeciwnowotworowe efekty, ale mo dobrze znano rola we prōmowaniu wzrōstu i przerzutōw raka jajnikōw (31-33). Podle doniesiyń stynżynie TNFα w ascycie i tkankach nowotworowych u pacjyntōw z rakym jajnikōw je srogsze aniżeli w tkankach dobroczynnych (34-36). W ôdniesiyniu do mechanizmu, TNFα może sztalować aktywacyjo, funkcyjo i proliferacyjo biołych krwinek, jak tyż pōmiyniać fynotyp kōmōrek nowotworowych (37, 38). Zgodnie z tymi ôdkryciami, rōżnicowo analiza ekspresyje gynōw wykozała, iże TNF bōł znaczōnco wzglyndym regulowany w kōmōrkach T w tkankach nowotworowych w porōwnaniu z ascytōm (Figura 5C). Wzrōst ekspresyje TNF bōł widzialny ino w populacyjach kōmōrek T z niycytotoksycznym fynotypym (Figura S5A). Podsumowujōnc, te dane potwierdzajōm poglōnd, iże MNA mo podwōjne efekty immunosupresyjne i prōmujōnce guz w HGSC.
Głōwnōm metodōm badanio metabolizmu TIL stało sie fluorescyncyjne ôznakowanie oparte na cytōmetryji przepływowyj. Te badania wykozały, iże w porōwnaniu z limfocytami ôbwodowyj krwie abo kōmōrkami T z wtōrnych ôrganōw limfoidnych, mysie i ludzke TIL majōm srogszo tyndyncyjo do pochłōnianio glukozy (4, 39) jak tyż stopniowo utrata funkcyje mitochōndrialnyj (19, 40). Chocioż zaôbserwowali my podobne wyniki w tym badaniu, kluczowym rozwojym je porōwnanie metabolizmu kōmōrek nowotworowych i TIL z tyj samyj resekcyjnyj tkanki nowotworowyj. Zgodnie z niykerymi z tych piyrwyjszych reportōw, kōmōrki nowotworowe (CD45-EpCAM +) z ascytu i nowotworōw majōm srogsze pochłōnianie glukozy aniżeli kōmōrki T CD8 + i CD4 +, co potwierdzo, iże wysoke pochłōnianie glukozy bez kōmōrki nowotworowe idzie porōwnać z kōmōrkami T. Kōncepcyjo kōnkuryncyje kōmōrek T. TME. Jednak aktywność mitochōndrialno kōmōrek nowotworowych je srogszo aniżeli aktywność kōmōrek CD8 + T, ale aktywność mitochōndrialno je podobno do aktywności kōmōrek CD4 + T. Te wyniki zmocniajōm powstowajōncy tymat, iże metabolizm oksydacyjny je wożny do kōmōrek nowotworowych (41, 42). Sugerujōm tyż, iże kōmōrki CD8 + T mogōm być barzij podatne na dysfunkcyjo oksydacyjno aniżeli kōmōrki CD4 + T, abo iże kōmōrki CD4 + T mogōm używać zdrzōdeł wōnglo inkszych aniżeli glukoza do utrzimanio aktywności mitochōndrialnyj (43, 44). Noleży dojzdrzeć, iże niy zaôbserwowaliśmy żodnych rōżnic w pochłōnianiu glukozy abo aktywności mitochōndrialnyj miyndzy efektorami CD4 + T, pamiyńciōm efektorōw T i kōmōrkami pamiyńci cyntralnyj T w ascycie. Podanie, stōn rōżnicowanio kōmōrek CD8 + T w nowotworach niy mo nic wspōlnego ze zmianami w pochłōnianiu glukozy, co podkryślo znaczōnco rōżnica miyndzy kōmōrkami T chowanymi in vitro a ludzkim TIL in vivo (22). Te ôbserwacyje były tyż potwierdzōne bez użycie bezstrōnnyj autōmatycznyj alokacyje populacyje kōmōrek, co dalij pokozało, iże kōmōrki CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ô srogszym pochłōnianiu glukozy i aktywności mitochōndrialnyj aniżeli kōmōrki nowotworowe sōm powszechne, ale majōm metaboliczno aktywno populacyjo kōmōrek. Ta populacyjo może reprezyntować dōmniymano subpopulacyjo kōmōrek supresorowych mieloidalnych abo plazmocytoidalnych kōmōrek dendrytycznych zidyntyfikowanych w analizie scRNA-seq. Chocioż ôba ône były zgłoszōne w ludzkich nowotworach jajnikōw [45], durch potrzebujōm Dalszym robotōm je ôpisanie tyj subpopulacyje mieloidalnyj.
Chocioż metody ôparte na cytōmetryji przepływowyj mogōm wyklarować ôgōlne rōżnice we glukozie i metabolizmie oksydacyjnym miyndzy zortami kōmōrek, akuratne metabolity produkowane bez glukoza abo inksze zdrzōdła wōnglo do metabolizmu mitochōndrialnego w TME niy były jeszcze ôkryślōne. Przipisanie ôbecności abo braku metabolitōw do danego podzbioru TIL wymogo ôczyszczynio populacyje kōmōrek z wyciyntyj tkanki. Beztōż nasz metoda zbogacynio kōmōrek w połōnczyniu ze spektrōmetryjōm masowōm może dostarczyć wglōndu na metabolity, co sōm rōżnicowo zbogacōne w kōmōrki T i populacyje kōmōrek nowotworowych we sztimujōncych prōbkach pacjyntōw. Chocioż ta metoda mo przewogi przed zortowaniym kōmōrek aktywowanym bez fluorescyncyjo, niykere bibliotyki metabolitōw mogōm być wpłyniynte skuli niyôdłōncznyj stabilności i/abo gibkigo tympa ôbrōtu (22). Niymynij jednak nasz metoda poradziyła zidyntyfikować dwa rozpoznane immunosupresyjne metabolity, adenozyna i kynurenina, pōniywoż ône rōżniōm sie moc miyndzy zortami prōbek.
Naszo metabonōmiczno analiza nowotworōw i podtypōw TIL dostarczo wiyncyj wglōndu na rola metabolitōw w TME jajnikōw. Po piyrsze, ze użyciym cytōmetryje przepływowyj, ustalili my, iże niy ma rōżnice w aktywności mitochōndrialnyj miyndzy nowotworami a kōmōrkami CD4 + T. Jednak analiza LC-MS/MS wykozała znaczōnce zmiany w hojności metabolitōw postrzōd tych populacyjōw, co wskozuje na to, iże antragi na tymat metabolizmu TIL i jego ôgōlnyj aktywności metabolicznyj wymogajōm akuratnyj interpretacyje. Po druge, MNA je metabolitym ô nojsrogszyj rōżnice miyndzy kōmōrkami CD45 a kōmōrkami T we ascycie, a niy nowotworach. Bezto kōmpartymentalizacyjo i lokalizacyjo nowotworu mogōm mieć roztōmajty wpływ na metabolizm TIL, co podkryślo możliwo heterogyniczność w danym mikrostrzodowisku. Po trzecie, ekspresyjo ynzymu produkujōncego MNA NNMT je głownie ôgraniczōno do CAF, to znaczy w myńszym stopniu kōmōrkami nowotworowymi, ale wykrywalne poziōmy MNA sōm ôbserwowane w kōmōrkach T pochodzōncych z nowotworu. Nadekspresyjo NNMT w CAF jajnikowych mo znany efekt prōmujōncy raka, czynściowo skuli prōmowanio metabolizmu CAF, inwazyje nowotworu i przerzutōw (27). Chocioż ôgōlny poziōm TIL je strzedni, ekspresyjo NNMT w CAF je ściśle zwiōnzano z podtypym mezynchymalnym Atlas Genōmu Raka (TCGA), kery wiōnże sie ze słabym prognozōm (27, 46, 47). Yntlich, ekspresyjo ynzymu AOX1 zapowiedzialnego za degradacyjo MNA je tyż ôgraniczōno do populacyje CAF, co wskazuje na to, iże kōmōrki T niy majōm zdolności do metabolizowanio MNA. Te wyniki potwierdzajōm idyjo, iże chocioż do weryfikacyje tego ôdkrycio potrzebne sōm dalsze roboty, wysoki poziōm MNA w kōmōrkach T może wskazować na ôbecność immunosupresyjnego mikrostrzodowiska CAF.
Bierōnc pod uwoga niski poziōm ekspresyje transporterōw MNA i niywykrywalny poziōm kluczowych biōłtek bierōncych udział w metabolizmie MNA, ôbecność MNA w kōmōrkach T je niyôczekowano. Ani NNMT, ani AOX1 niy mogły być wykryte bez analiza scRNA-seq i cylowano qPCR dwōch niyznoleżnych kohort. Te wyniki wskazujōm, iże MNA niy ma syntetyzowane bez kōmōrki T, ale wchłōniane z ôbtoczajōncego TME. Eksperymynta in vitro pokozujōm, iże kōmōrki T majōm tyndyncyjo do grōmadzynio egzogynicznego MNA.
Nasze badania in vitro wykozały, iże egzogyniczne MNA indukuje ekspresyjo TNFα w kōmōrkach T i zwiynkszo wiōnzanie Sp1 z prōmotorym TNFα. Chocioż TNFα mo tak funkcyje przeciwnowotworowe, jak i przeciwnowotworowe, w raku jajnikōw TNFα może prōmować wzrōst raka jajnikōw (31-33). Neutralizacyjo TNFα w chowaniu kōmōrek nowotworowych jajnikōw abo eliminacyjo sygnału TNFα w mysich modelach może poprawić produkcyjo cytokin zapalnych pośredniczōnych bez TNFα i hamować wzrōst nowotworu (32, 35). Bezto w tym przipadku MNA pochodzōnce z TME może działać za prozapalny metabolit bez mechanizm znoleżny ôd TNFα bez pylta autokrynno, prōmujōnc tym samym wystōmpiynie i rozprzestrzynianie sie raka jajnikōw (31). Na bazie tyj możliwości blokada TNFα je badano jako potyncjalny środek terapeutyczny w przipadku raka jajnikōw (37, 48, 49). Ôkrōm tego MNA zmyńszo cytotoksyczność kōmōrek CAR-T wobec kōmōrek nowotworowych jajnikōw, co dostarczo dalszych dowodōw na pośredniczōno bez MNA immunologiczno supresyjo. Zbiornie te wyniki sugerujōm model, w kerym nowotwory i kōmōrki CAF wydzielajōm MNA do pozakōmōrkowego TME. Bez (i) stymulacyjo wzrōstu raka jajnikōw indukowano bez TNF i (ii) hamowanie aktywności cytotoksycznyj kōmōrek T indukowano bez MNA, może to mieć podwōjny efekt tumorowy (Figura 5D).
Podsumowujōnc, bez zastosowanie kōmbinacyje gibkigo zbogacynio kōmōrek, sekwyncjōnowanio jednokōmōrkowego i profilowanio metabolicznego, to podszukowanie wykozało ôgrōmne rōżnice immunōmetabolōmiczne miyndzy nowotworami i kōmōrkami ascytu u pacjyntōw z HGSC. Ta wszechstrōnno analiza wykozała, iże sōm rōżnice we pochłōnianiu glukozy i aktywności mitochōndrialnyj miyndzy kōmōrkami T i zidyntyfikowała MNA za niykōmōrkowy autōnōmiczny metabolit immunologiczny regulacyjny. Te dane majōm wpływ na to, w jaki spōsōb TME wpływo na metabolizm kōmōrek T w ludzkich nowotworach. Chocioż zgłoszōno bezpostrzednio kōnkurowanie ô skłodniki ôdżywcze miyndzy kōmōrkami T a kōmōrkami nowotworowymi, metabolity mogōm tyż działać za postrzednie regulatorzi, coby prōmować progresjyjo nowotworu i możno sniżać endogynne ôdpowiedzi immunologiczne. Dalszy ôpis funkcjōnalnyj roli tych regulacyjnych metabolitōw może ôtworzyć alternatywne strategije zwiynkszynio przeciwguzkowyj immunologicznyj ôdpowiedzi.
Prōbki ôd pacjyntōw i dane kliniczne były uzyskane bez repozytorium tkanek nowotworu raka BC certyfikowane ôd Kanadyjskigo Necu Repozytorium Tkanek. Podle protokołu zatwierdzōnego ôd Kōmitytu Etycznego Podszukowań nad Rakiym BC i Uniwerzytetu Kolumbii Brytyjskij (H07-00463), wszyske prōbki i dane kliniczne ôd pacjyntōw uzyskały informowano pisymno zgoda abo formalnie zrezygnowały ze swojij zgody. Prōbki sōm przechowowane w certyfikowanyj Biobanku (BRC-00290). Szczegōłowe cychy pacjyntōw sōm pokozane w tabułach S1 i S5. Do krioprezerwacyje skalpel je używany do mechanicznego rozkłodanio prōbki nowotworu ôd pacjynta, a potym przeciśniyńcio jij bez 100-mikrōnowy filtr, coby dostać jednokōmōrkowo suspensyjo. Ascyta ôd pacjynta była ôdwirowano przi 1500 ôbr/min bez 10 minut w tymperaturze 4°C, coby peletować kōmōrki i usuniynć supernatant. Kōmōrki pozyskane z nowotworu i ascytu były kriokonserwowane we 50% ludzkim serum AB inaktywowanym ciepłym (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) i 10% siarczanku dimetylu. Te zachowane jednokōmōrkowe suspensyje były roztopiōne i używane do ôpisanych niżyj metabolomiki i determinacyje metabolitōw.
Kōmpletne ôstrzodek skłodo sie z 0,22 μm przefiltrowanego 50:50 dopołniōnego RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutaminy (Thermo Fisher Scientific) dopołniōno 10% ciepłym inaktywowanym ludzkim serumym AB (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutaminy (Thermo Fisher Scientific) Roztwōr streptōmycyny (PenStrep) i 50 μMB-merkaptoetanolu. AimV (Invitrogen) je dopołniōny 20 mM Hepesōw (Thermo Fishera Naukowe) i 2 mM l-glutaminy (Thermo Fishera Naukowe). Bufer farbiynio cytōmetra przepływu skłodoł sie z 0,22 μm przefiltrowanyj fosforanowyj buforowanyj sōlnyj wody (PBS; Invitrogen) dopołniōnyj 3% ludzkim serumym AB inaktywowanym ciepłym (Sigma). Bufer zbogacynio kōmōrek skłodo sie z 0,22 μm przefiltrowanego PBS i dopołniōny 0,5% ludzkim serumym AB inaktywowanym termicznie (Sigma-Aldrich).
W kōmpletnym ôstrzodku w tymperaturze 37°C kōmōrki były farbiōne 10 nM MT DR i 100 μM 2-NBDG bez 30 minut. Potym kōmōrki były farbiōne farbnikiym żywotności eF506 w tymperaturze 4°C bez 15 minut. Resuspendować kōmōrki w bloku FC (eBioscience) i brilliantnym buforze farbiynio (BD Biosciences), roztworzyć we buforze farbiynio cytōmetra przepływu (podle instrukcyje producenta) i inkubować bez 10 minut w tymperaturze pokojowyj. Farbić kōmōrki zestawym przeciwciał (Tabula S2) we buforze farbiynio cytōmetryje przepływowyj w tymperaturze 4°C bez 20 minut. Przed analizōm ponownie zasuspendować kōmōrki we buforze farbiynio cytōmetryje przepływowyj (Cytek Aurora; kōnfiguracyjo 3L-16V-14B-8R). Użyj SpectroFlo i FlowJo V10 do analizy danych rachowanio kōmōrek, a do stworzynio danych użyj GraphPad Prism 8. Strzednio intynsywność fluorescyncyje (MFI) 2-NBDG i MT DR była log-normalizowano, a potym do statystycznyj analizy użyto dwojistego testu t, coby uwzglyndnić sztimujōnce pacjynty. Usuń z analizy wszyske populacyje z mynij jak 40 zdarzyniami; wkludź wert MFI 1 dlo wszyskich wertōw ujymnych przed przekludzyniym statystycznyj analizy i wizualizacyje danych.
Coby uzupełnić strategijo ryncznego bramowanio powyższego panelu procesowego, użyli my połnyj adnotacyje bez drzewo ôgraniczyń kształtu (FAUST) (21), coby autōmatycznie przipisać kōmōrek do populacyje po wyeliminowaniu martwych kōmōrek we FlowJo. Ryncznie zarzōndzamy wyjściym, coby łōnczyć populacyje, co wydajōm sie być źle alokowane (połōnczynie PD1+ z kōmōrkami nowotworowymi PD1) i utrzimane populacyje. Kożdo prōbka zawiyro strzednio wiyncyj jak 2% kōmōrek, dlo cołkości 11 populacyji.
Ôdwirowanie tyngości gradiyntu fikolu było użyte do ôddzielanio PBMC ôd produktōw separacyje leukocytōw (STEMCELL Technologies). Kōmōrki CD8 + T były wyizolowane z PBMC ze użyciym mikrokorlikōw CD8 (Miltenyi) i rozbudzane we kōmpletnym ôstrzodku ze użyciym TransAct (Miltenyi) bez 2 tydnie zgodnie z instrukcyjami producenta. Kōmōrki pozwolōno stać bez 5 dni we kōmpletnym ôstrzodku zawiyrajōncym IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), a potym zaś stymulowano ze pōmocōm TransAct. W 7. dniu, zgodnie z instrukcyjami producenta, ludzke CD45 MicroBeads (Miltenyi) były używane do zbogacanio kōmōrek w trzech dalszych rōndach. Kōmōrki były alikwotowane do analizy cytōmetryje przepływowyj (jak ôpisano powyżyj), a milijōn kōmōrek było alikwotowane trzi razy do analizy LC-MS/MS. Prōbki były przetworzōne ze pōmocōm LC-MS/MS, jak ôpisano niżyj. Szacowali my brakujōnco wartość metabolitu przi liczbie jōnōw 1000. Kożdo prōbka je normalizowano bez cołkowito liczba jōnōw (TIC), logarytmicznie przekształcano i autōmatycznie normalizowano we MetaboAnalystR przed analizōm.
Pojedynczokōmōrkowo suspensyjo kożdego pacjynta była roztopiōno i przefiltrowano bez 40 μm filtr do kōmpletnego ôstrzodka (jak ôpisano powyżyj). Podle protokołu producenta, trzi dalsze cykle pozytywnyj selekcyje bez magnetyczne separacyjo koralikōw ze użyciym MicroBeads (Miltenyi) były użyte do zbogacynio prōbek kōmōrek CD8+, CD4+ i CD45- (na lodzie). Krōtko godajōnc, kōmōrki sōm resuspendowane we buforze bogacynio kōmōrek (jak ôpisano powyżyj) i rachowane. Kōmōrki były inkubowane z ludzkimi koralikami CD8, ludzkimi koralikami CD4 abo ludzkimi koralikami CD45 (Miltenyi) w tymperaturze 4°C bez 15 minut, a potym przemywane buforym bogacynio kōmōrek. Prōbka je przepuszczano bez kolōmna LS (Miltenyi), a ułōmki dodatnie i ujymne sōm zebrane. Coby skrōcić czas trwanio i zmaksymalizować etap ôdbudowy kōmōrek, frakcyjo CD8 je potym używano do drugij rōndy zbogacynio CD4+, a frakcyjo CD4 je używano do dalszego zbogacynio CD45. Trzimaj roztwōr na lodzie bez cołki proces separacyje.
Coby przigotować prōbki do analizy metabolitōw, kōmōrki były przemywane raz lodowo zimnym roztworym soly, a do kożdyj prōbki przidowano 1 ml 80% metanolu, potym wirowano i zamrożōno we ciekłym azocie. Prōbki poddano trzech cyklōm zamrożynio-rozmrożynio i ôdwirowane przi 14 000 ôbr/min bez 15 minut w tymperaturze 4°C. Supernatant zawiyrajōncy metabolity je parowany do suchości. Metabolity były zaś rozpuszczane w 50 μl 0,03% kwasu mrziwiowego, wirowane do miyszanio, a potym ôdwirowane, coby usuniynć zaniyczyszczynia.
Ekstraktować metabolity, jak ôpisano powyżyj. Przenieś supernatant do wysokowydajnyj butelki chrōmatografije ciekłych do podszukowań nad metabolōmikōm. Użyj losowego protokołu lyczynio do lyczynio kożdyj prōbki podobnōm wielościōm kōmōrek, coby zapobiyc efektōm seriowym. Przekludziyliśmy jakościowo ôcyna globalnych metabolitōw wczasnij ôpublikowanych na potrōjnym kwadrupolowym spektrōmetrze masowym AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Analiza chrōmatograficzno i ​​integracyjo ôbszaru szpic były przekludzōne ze użyciym ôprogramowanio MultiQuant wersyje 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Rachowanie jōnōw 1000 było użyte do ôszacowanio brakujōncyj werty metabolitu, a TIC kożdyj prōbki było użyte do ôbliczanio znormalizowanyj pola szpice kożdego wykrytego metabolitu, coby skorygować zmiany wkludzōne bez insztrumyntalno analiza z przetworzanio prōbki. Po znormalizowaniu TIC, MetaboAnalystR(51) (parametr domyślny) je używany do kōnwersyje logarytmicznyj i autōmatycznego skalowanio linije normowyj. Użyliśmy PCA z wegańskim pakietym R do przekludzynio eksploracyjnyj analizy rōżnic metabolōmu miyndzy zortami prōbek, a użyliśmy czynściowyj analizy redundancyje do analizy pacjyntōw. Użyj metody Warda do kōnstruowanio dendrogramu karty ciepła do skupiynio euklidesowyj ôdległości miyndzy prōbkami. Użyliśmy limma (52) na standaryzowanyj hojności metabolitōw do idyntyfikacyje rōżnicowo hojnych metabolitōw w cołkij zorcie kōmōrkowyj i mikrostrzodowisku. Coby upraszczyć wyklarowanie, używōmy parametra strzednij grupy do ôkryślynio modelu i rozwożōmy zorty kōmōrek w mikrostrzodowisku za kożdo grupa (n = 6 grup); w przipadku testu znaczōństości przekludziyliśmy trzi powtarzajōnce sie pōmiary dlo kożdego metabolitu Coby uniknōńć fałszywyj replikacyje, pacjynt bōł włōnczōny za przeszkoda w projektie limma. Coby wybadać rōżnice w metabolitach miyndzy roztōmajtymi pacjyntami, przipasowali my model limma w tym pacjyntōw we stały spōsōb. Ôdnotowujymy znaczynie wczasnij ôkryślōnego kōntrastu miyndzy zortōm kōmōrki a mikrostrzodowiskym Padj <0,05 (korekcyjo Benjamini-Hochberga).
Po zbogacyniu wigoru ze użyciym Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% żywotność), sekwyncjōnowanie jednokōmōrkowego transkryptōmu przekludzōno na cołkowitych żywych zamrożōnych prōbkach ascytu i nowotworu ze użyciym protokołu ekspresyje 10x 5′gynu. Analizowało sie piyńć przipodkōw ze sztimujōncymi nowotworami i ascytōm, chocioż nisko żywotność jednyj prōbki nowotworu niy dozwolyła na jeji włōnczynie. Coby ôsiōngnōńć mocka selekcyjōw pacjyntōw, połōnczyli my prōbki kożdego pacjynta we szlakach 10-krotnego kōntrolera chrōmu i ôsobno przeanalizowali ascyta i miyjsca nowotworu. Po sekwyncjōnowaniu [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp sparowany kōńc (PE), gynōm Quebecu; strzednio 73 488 i 41 378 ôdczytōw na kōmōrka ôdpednio dlo nowotworu i ascytu]], użyliśmy CellSNP i Vireo (53) (podle CellSNP jako Spōlny ludzki SNP (VCF) dostarczōny bez GRCh38 je przipisowany tożsamość gynotypu I status pacjynta closety. Używōmy SNPRelate do (IBS), z wyjōntkym niyprzipisanych kōmōrek i kōmōrek zidyntyfikowanych jako dupleksy i sztimujōncych dowcōw miyndzy prōbkami ascytu i nowotworu (54, zachowali my trzi przipadki z ôbfitōm reprezyntacyjōm kōmōrek w nowotworze i ascycie do analizy downstream (scConduo pa5). dało 6975 kōmōrek (ôdpednio 2792 i 4183 kōmōrek z nowotworu i ascytu) do analizy Używōmy klastrowanio Louvain spōlnego nojbliższego necu sōmsiadōw (SNN) ôpartyj na ôdległości Jaccarda do kōmōrek klastrowych bez ekspresyjo markyrowano na ryncznie. i wizualizowane ze t-SNE kōmōrki T sōm zdefiniowane bez ekspresyjo CD8A i GZMA, z wyjōntkym subklastry z niskim ekspresyjōm rybosōmalnego biōłtka Dostałyśmy dostymp do ôpublikowanych danych ôd Izar et al (16), w tym jejich ôsadzanio t-SNE, mogōm kōntrolować nakłodanie sie ekspresyje miyndzy kōmōrkami immunologicznymi.
PBMC były ôddzielane ôd produktōw separacyje leukocytōw (STEMCELL Technologies) bez ôdwirowanie tyngości gradientu Ficolla. Kōmōrki CD3 + były wyizolowane z PBMC ze użyciym koralikōw CD3 (Miltenyi). W ôbecności abo braku MNA kōmōrki CD3+ były aktywowane ze CD3 zwiōnzanym z platami (5 μg/ml), rozpuszczalnym CD28 (3 μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukina). W ôstatnim dniu ekspansji żywotność (Farbnik ô utrwalyniu żywotności eFluor450, eBioscience) i proliferacyjo (123 liczby eBeads, Thermo Fisher Scientific) były ôcyniane ze pōmocōm cytōmetryje przepływowyj. Ôcyńć funkcyjo efektora bez stymulacyjo kōmōrek PMA (20 ng/ml) i jōnōmycynōm (1 μg/ml) GolgiStop bez 4 godziny, jak tyż mōnitorować CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend (Mb11, bd). Stymulować kōmōrki qPCR i ChIP PMA (20 ng/ml) i jōnōmycynōm (1μg/ml) bez 4 godziny. Supernatant ELISA bōł zebrany przed i po stymulacyji PMA (20 ng/ml) i jōnōmycynōm (1 μg/ml) bez 4 godziny.
Postympuj protokoł producenta, coby wyizolować RNA ze pōmocōm mini-zestawu RNeasy Plus (QIAGEN). Do hōmogynizacyje prōbki użyj rozdrobnika QIA (QIAGEN). Użyj wysokopojymnościowego zestawu RNA do cDNA (Thermo Fisher Scientific) do syntezy kōmplymyntarnego DNA (cDNA). Użyj gibkigo zaawansowanego miszōngu głōwnego TaqMan (Thermo Fisher Scientific) do kwantyfikacyje ekspresyje gynōw (podle protokołu producenta) ze pōmocōm nastympujōncych sōnd: Hs02786624_g1 [fosforan gliceraldehydu-3 ôd wodoru (GAPDH)] i Hs01010726_m1 (SLC22A2). Prōbki były przekludzane na systymie PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlus (Stōsowane Biosystymy) (Stōsowane Biosystymy) na gibkij ôptycznyj 96-domkowyj platy reakcyjnyj MicroAmp (Stōsowane Biosystymy) z ôptycznōm foliōm MicroAmp. Kożdy wert Ct, co przekroczo 35, je uwożany za powyżyj progu wykrywanio i je ôznaczany za niywykrywalny.
Wykōnaj ChIP jak ôpisano wczasnij (58). Krōtko godajōnc, kōmōrki były ôbsudzane formaldehydym (ôstateczne stynżynie 1,42%) i inkubowane w tymperaturze pokojowyj bez 10 minut. Używać dopołniōnego bufora ôbtuczajōncego (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0,1% NP-40) na lodzie bez 10 minut, potym zaś suspendować w buforze immunoprecypitacyjnym, jak ôpisano (58 ). Prōbka była potym ultradźwigniōno ze nastympujōncymi cyklami: 10 cyklōw (20 1-sekundowych impulsōw) i czas statyczny 40 sekund. Inkubować przeciwciała immunoglobuliny G klasy ChIP (technologijo sygnalizacyje kōmōrkowyj; 1μl), histōnu H3 (technologijo sygnalizacyje kōmōrkowyj; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) i SP1 (technologijo sygnalizacyje kōmōrkowyj; 3μl) z prōbkōm nad 4°CCn. Inkubować koraliki biōłtka A (Thermo Fisher Scientific) ze prōbkōm w tymperaturze 4°C przi delikatnym wstrzōsaniu bez 1 godzina, potym użyć koralikōw chelex (Bio-Rad) do zbogacynio DNA i użyć biōłtka K (Thermo Fisher) do trowiynio biōłtek. Prōmotōr TNFα bōł wykryty bez PCR: do przodka, GGG TAT CCT TGA TGC TGT; przeciwnie, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt ô 207 bp). Ôbrazy były stworzōne ôd Image Lab (Bio-Rad) i ôkryślōne ze pōmocōm ôprogramowanio ImageJ.
Supernatant chowanio kōmōrkowego bōł zebrany tak, jak ôpisano powyżyj. Determinacyjo przekludzōno zgodnie z procedurami producenta ludzkigo zestawu ELISA TNFα (Invitrogen), ludzkigo zestawu ELISA IL-2 (Invitrogen) i ludzkigo zestawu ELISA IFN-γ (Abcam). Podle protokołu producenta, supernatant bōł roztworzōny w proporcyji 1:100 do wykrycio TNFα i IL-2, jak tyż 1:3 do wykrycio IFN-γ. Użyj czytnika wieloznakowego EnVision 2104 (PerkinElmer) do pōmiary pochłōnialności przi 450 nm.
PBMC były ôddzielane ôd produktōw separacyje leukocytōw (STEMCELL Technologies) bez ôdwirowanie tyngości gradientu Ficolla. Kōmōrki CD3 + były wyizolowane z PBMC ze użyciym koralikōw CD3 (Miltenyi). W ôbecności abo braku MNA kōmōrki CD3+ były aktywowane ze CD3 zwiōnzanym z platami (5 μg/ml), rozpuszczalnym CD28 (3 μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukina) bez 3 dni. Po 3 dniach kōmōrki były zebrane i przemywane 0,9% sōlnym roztworym, a pelet bōł zamrożōny. Rachowanie kōmōrek przekludzano ze pōmocōm cytōmetryje przepływowyj (Cytek Aurora; kōnfiguracyjo 3L-16V-14B-8R) ze użyciym 123 rachowanio eBeads.
Ekstraktować metabolity, jak ôpisano powyżyj. Suszōny ekstrakt bōł zrekōnstytuowany we stynżyniu 4000 ôdpednikōw kōmōrek/μl. Analizuj prōbka ze pōmocōm chrōmatografije ôpacznyj fazy (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornijo) i kolōny CORTECS T3 (2,1×150 mm, miara tajleczek 1,6 μm, miara porōw 120 Å; #186008500). Spektrōmetr masowy polarny (6470, Agilent), co w nim jōnizacyjo elektrosprōchniowo działo we trybie pozytywnym. Mobilno faza A to 0,1% kwasu mrziwnego (w H2O), mobilno faza B to 90% acetōnitrilu, 0,1% kwasu mrziwnego. Gradiynt LC wynosi ôd 0 do 2 minut dlo 100% A, ôd 2 do 7,1 minut dlo 99% B i ôd 7,1 do 8 minut dlo 99% B. Potym zaś wyrōwnoważ kolōmna z fazōm mobilnōm A przi przepływie 0,6 ml/min bez 3 minuty. . Przepływ wynosi 0,4 ml/min, a komora kolōny je ôgrzywano do 50°C. Użyj czystyj chymicznyj sztandardu MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Pōłnocny Jork, Ôntario, Kanada) do ustalynio czasu zatrzymanio (RT) i transformacyje (RT = 0,882 minut, transformacyjo 1 = 137→94,1, transformacyjo 2 = 137→wersyjo→372). Kej wszyske trzi przechody zachodzōm we ôdpednim czasie retyncyje, przechōd 1 je używany do kwantyfikacyje, coby zapewnić specyficzność. Standardowo krzywo MNA (Toronto Research Chemical Company) była wygynerowano bez szejś seryjnych roztworzyń roztworu zasobowego (1 mg/ml), coby uzyskać standardy ôdpednio 0,1, 1,0, 10 i 100 ng/ml jak tyż 1,0 i 10 μg/ml ciekłych. Granica wykrywanio wynosi 1 ng/ml, a lynijowo ôdpowiydź wynosi ôd 10 ng/ml do 10μg/ml. Kożdo injekcyjo dwōch mikrolitrōw prōbki i standardu je używano do analizy LC/MS, a miyszano prōbka kōntrole jakości je przekludzano co ôziym injekcyji, coby zapewnić stabilność platformy analizy. Ryakcyje MNA wszyskich prōbek kōmōrek lyczōnych MNA były we lynijowym zakresie testu. Analiza danych przekludzōno ze użyciym ôprogramowanio do wielościowyj analizy MassHunter (v9.0, Agilent).
Kōnstrukt αFR-CAR drugij gyneracyje bōł pobrany ôd Song et al. (59). Krōtko godajōnc, kōnstrukt zawiyro nastympujōnce zawartości: sekwyncyjo lidera CD8a, specyficzny do ludzkigo αFR fragmynt zmiynny jednolyńcuchowy, zawōr CD8a i regiōn transbłōnnowy, dōmyna wewnōntrzkōmōrkowo CD27 i dōmyna wewnōntrzkōmōrkowo CD3z. Kōmpletno sekwyncyjo CAR była zsyntetyzowano ôd GenScript, a potym sklōnowano do wektora ekspresyje lentywirusowego drugij gyneracyje przed kasetōm ekspresyjōm GFP użytōm do ôcyny posiywności transdukcyje.
Lentywirus je produkowany bez transfekcyjo kōmōrek HEK293T [Amerykōńsko Kolekcyjo Kultur Typowych (ATCC); chowane we zmodyfikowanym ôstrzodku Eagle ôd Dulbecco, co zawiyro 10% płodowego serum bydła (FBS) i 1% PenStrep, i używane wektora CAR-GFP i plazmidy pakowanio (psPAX2 i pMD2.G, Addgene) używajōm lipofekcyjnyj aminy (Sigma-Aldrich). Zawiyrajōncy wirus supernatant bōł zebrany 48 i 72 godziny po transfekcyji, przefiltrowany i skōncyntrowany bez ultracentryfugacyjo. Skōncetrowany supernatant wirusowy przechowuje w tymperaturze -80°C do transdukcyje.
PBMC sōm ôddzielane ôd zdrowych produktōw separacyje leukocytōw dowcy (STEMCELL Technologies) bez ôdwirowanie tyngości gradientu Ficolla. Użyj mikrokorlikōw CD8 z pozytywnōm selekcyjōm (Miltenyi) do wyizolowanio kōmōrek CD8+ z PBMC. Stymulować kōmōrki T ze pōmocōm TransAct (Miltenyi) i we ôstrzodku TexMACS [Miltenyi; dopołniōne 3% ludzkim serumym inaktywowanym bez ciepło, 1% PenStrep i IL-2 (300 U/ml)]. Dwadzieścia sztyry godziny po stymulacyji kōmōrki T były transdukowane lentywirusym (10 μl stynżōnego supernatantu wirusa na 106 kōmōrek). 1 do 3 dni po transdukcyji na Cytek Aurora (na FSC (Rozproszanie do przodka)/SSC (Rozproszanie boczne), Singlet, GFP+), ôcynij ekspresyjo GFP kōmōrek, coby wykozać posiywność transdukcyje na poziōmie aby 30% .
Kōmōrki CAR-T były chowane bez 24 godziny w Immunocult (technologije STEMCELL; dopołniōne 1% PenStrep) w nastympujōncych warōnkach: niylyczōne, lyczōne 250 μM adenozynōm abo 10 mM MNA. Po przedlyczyniu kōmōrki CAR-T były przemywane PBS i połōnczōne z 20 000 kōmōrkami SK-OV-3 [ATCC; we ôstrzodku McCoy 5A (Sigma-Aldrich) dopołniōnym 10% FBS i 1% PenStrep przi 10: Stosunek efektora do cylu 1 bōł zmocniōny w trzech ôdpowiednikach we dopołniōnym ôstrzodku Immunocult. Kōmōrki SK-OV-3 i kōmōrki SK-OV-3 lizowane ze sapōninōm digitalis (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) były używane ôdpednio za ujymno i pozytywno kōntrola. Po 24 godzinach spōłkultywacyje supernatant zebrano, a dehydrogenaza mlyczanowo (LDH) zmierzōno zgodnie z instrukcyjami producenta (Kit do testu cytotoksyczności LDH Glo, Promega). Supernatant LDH bōł roztworzōny w proporcyji 1:50 we buforze LDH. Procynt zabiyć bōł mierzōny ze pōmocōm nastympujōncego wzoru: procynt zabicio = procynt korekcyje / maksymalny spōłczynnik zabicio x 100%, kaj procynt korekcyje = ino ko-kultury-kōmōrek T, a maksymalny spōłczynnik zabicio = pozytywno kōntrola-negatywno kōntrola.
Jak ôpisano w tekście abo materyjach i metodach, użyj GraphPada Prism 8, Microsoft Excela abo R v3.6.0 do statystycznyj analizy. Jeźli ôd jednego pacjynta pobrano wiela prōbek (takich jak ascyta i nowotwor), używōmy dwojistego testu t abo włōnczōmy pacjynta za losowy efekt we lynijowym abo uôgōlniōnym modelu, jak ôdpednio. W przipadku analizy metabolōmicznyj test znaczynio je przekludzany w trzech eksemplarach.
Coby zapoznać sie z ekstra materyjami do tego artykułu, patrz http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Je to artykuł z ôtwartym dostympym dystrybuowany na warōnkach Licyncyje Creative Commons Attribution-Non-Commercial, co przizwolo na użycie, dystrybucyjo i reprodukcyjo w leda jakim medium, podwiela ôstateczne użycie niy ma dlo kōmercyjnego zysku, a założyniym je to, iże ôryginalno robota je noleżno. Ôdniesiynie.
Napomniynie: Prosimy ino ô podanie twojigo adresu e-mail, coby ôsoba, kerõ rekōmyndujesz na strōna, wiedziała, iże chcesz, coby zoboczyła e-mail i że to niyma spam. Niy chwytamy żodnych adresōw e-mail.
To pytanie je używane do przetestowanio, eli jesteś gościym i do zapobiyganio autōmatycznymu przesyłaniu spamu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jones, Ralph J. De Bells (Brad H. Nelson). (Russell G. Jones), Fineas T. Hamiltōn (Fineas T.
MNA prziczynio sie do immunologicznyj supresyje kōmōrek T i reprezyntuje potyncjalny cyl immunoterapije do lyczynio ludzkigo raka.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Jones, Ralph J. De Bells (Brad H. Nelson). (Russell G. Jones), Fineas T. Hamiltōn (Fineas T.
MNA prziczynio sie do immunologicznyj supresyje kōmōrek T i reprezyntuje potyncjalny cyl immunoterapije do lyczynio ludzkigo raka.
©2021 Amerykański Stowarziszynie dlo Postympu Nauki. wszyske prawa zastrzeżōne. AAAS je partnyrym ôd HINARI, AGORI, OARE, CHORU, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. Postympy Nauki ISSN 2375-2548.