Sortowanie biōłtek na sztrece sekretoryjnyj je niezbyndne do utrzimanio kōmpartymyntalizacyje kōmōrek i hōmeostazy. Ôkrōm zortowanio pośredniczōnego bez skorupa, rola lipidōw w zortowaniu kinezyn w procesie transportu sekretoryjnego je ôd downa istniyjōncym bazowym pytaniym, na kere niy ma jeszcze ôdpowiedzi. Tukej przekludzomy 3D symultaniczne wielofarbowe ôbrazowanie we czasie rzeczywistym we wysokij rozdzielczości, coby dowiyść in vivo, iże nowo zsyntetyzowane biōłtka unimobilizowane glikozylofosfatydylinozytolym z barzo dugimi ôgrōmkami lipidowymi ceramidowymi sōm skupiōne i klasyfikowane we wyspecjalizowane yndoplazmy Net usembrane exit site, co je miyjsce wyjścio transbrōny. Ôkrōm tego pokozujymy, iże dugość lyńcucha ceramidu we błōnie necu yndoplazmatycznego je krytyczno do tyj selektywności zortowanio. Nasze podszukowanie dostarczo piyrszych bezpostrzednich dowodōw in vivo na klasyfikacyjo ładunkōw biōłtkowych podle dugości lyńcucha lipidowego do selektywnych miyjsc eksportu na sztrece sekretoryjnyj.
W kōmōrkach eukariotycznych biōłtka syntetyzowane w necu yndoplazmatycznym (ER) sōm potym zortowane w czasie transportu bez sztreka sekrecyjno do dostarczynio do jejich ôdpednigo przeznaczynio kōmōrkowego (1). Ôkrōm zortowanio pośredniczōnego bez powłoka, ôd downa spekulowano, iże niykere lipidy mogōm tyż sużyć za selektywne pōnkty wyjściowe bez skupianie jejich w ôkryślōnych dōmynach błōnnowych, kere ôkryślajōm biōłtka (2-5). Jednak durch brakuje bezpostrzednich dowodōw in vivo, coby dowiyść tyn możliwy mechanizm ôparty na lipidach. Coby rozwiōnzać tyn bazowy problym, podszukowali my w drōżdżach, w jaki spōsōb biōłtka zakotwiczōne glikozylofosfatydylinozytolu (GPI) (GPI-AP) sōm rōżnicowo eksportowane z ER. GPI-AP to roztōmajte biōłtka powiyrchnie kōmōrkowyj połōnczōne z lipidami ( 6, 7). GPI-AP je wydzielanym biōłtkym prziłōnczōnym do zewnyntrznych listkōw błōny plazmatycznyj bez ôgrōmek glikolipidowy (kotwa GPI). Akceptujōm kotwy GPI jako kōnserwatywne posttranslacyjne modyfikacyje we przestrzyni ER (8). Po prziłōnczyniu GPI-AP przechodzi bez aparat Golgigo (5, 9) z ER do błōny plazmatycznyj. Ôbecność kotw GPI powoduje, iże GPI-AP je transportowany ôddzielnie ôd transbłōnnowych biōłtek wydzielanych (w tym inkszych biōłtek błōny plazmatycznyj) wzduż sztreki sekrecyjnyj (5, 9, 10). W kōmōrkach drōżdżowych GPI-AP sōm ôddzielane ôd inkszych wydzielanych biōłtek w necu yndoplazmatycznym, a potym pakowane w unikalne szynki ôwiniynte bez kōmpleks biōłtkowy ôbtoczki II (COPII) (6, 7). Determinanta tego procesu klasyfikacyje w procesie eksportu ER sōm niyklarowne, ale spekuluje sie, iże tyn mechanizm może wymogać lipidōw, ôsobliwie strukturalnego remodelowanio czynści lipidowyj kotwy GPI (5, 8). W drōżdżach remodelowanie lipidōw GPI zaczyno sie zaroz po prziłōnczyniu sie GPI, a w wielu przipadkach powoduje łōnczynie ceramidu z 26-wōnglowym kwasym nasycōnym tłuszczowym ô dugim lyńcuchu (C26:0) (11, 12). Ceramid C26 je dotychczas głownym ceramidym produkowanym ôd kōmōrek drōżdżowych. Je ôn syntetyzowany w ER, a wiynkszość z niego je eksportowano do aparatu Golgigo bez pęcherzyki COPII (13). Eksport ER GPI-AP wymogo kōnkretnie ciōngłyj syntezy ceramidōw (14, 15), a za to kōnwersyjo ceramidu na ceramid fosforanu inozytolu (IPC) w aparacie Golgigo zależy ôd syntezy kotwy GPI (16). Badania biofizyczne ze sztucznymi błōnami wykozały, iże barzo duge ceramidy lyńcucha acylowego mogōm łōnczyć sie, tworzōnc uporzōndkowane dōmyny ô unikalnych włosnościach fizycznych (17, 18). Te dane kludzōm do hipotezy, iże ceramid C26 i GPI-AP z ceramidym C26 używajōm swojich włosności fizycznych do łōnczynio sie we uporzōndkowane regiōny abo regiōny we stosōnkowo niechrōniōnym strzodowisku lipidowym błōny ER. Skłodo sie głōwnie z krōtkich i niynasycōnych glicerolipidōw (C16:1 i C18:1) (19, 20). Te regiōny bydōm selektywnie skupiōne na ôkryślōnych miyjscach wyjściowych ER (ERES), kaj GPI-AP ôparty na ceramidach i ceramidach mogōm być spōłtransportowane do Golgigo w tym samym dedykowanym pęcherzyku COPII (5).
W tym podszukowaniu dyrekt testowali my tyn mechanizm ôparty na lipidach bez użycie superrozdzielczościowyj kōnfokalnyj mikroskopije ôbrazowanio w czasie rzeczywistym (SCLIM), co je nojnowszōm technikōm mikroskopije, co może we tym samym czasie ôbserwować fluorescyncyjnie ôznakowane biōłtka. (21, 22).
Nojprzōd zastosowali my technologijo SCLIM, coby dalij zdefiniować, w jaki spōsōb normalny GPI-AP z grupōm ceramidowym C26 bōł przesiewany z transbłōnnowych wydzielanych biōłtek po ôpuszczyniu ER w S. cerevisiae. Coby wybadać klasyfikacyjo ER, użyliśmy systymu gynetycznego, kery może dyrekt wizualizować nowo zsyntetyzowany ładunek, kery wchodzi do ERES in vivo (7, 23). Za ładunek ôbrali my GPI-AP Gas1 ôparty na ceramidzie C26 ôznakowany zielōnym fluorescyncyjnym biōłtkym (GFP) i transbłōnnowe wydzielane biōłtko Mid2 ôznakowane blisko podczerwōnym fluorescyncyjnym biōłtkym (iRFP), co ôba cylujōm we błōna plazmowo (24-26). U mutanta wrażliwego na tymperatura sec31-1 te dwa ładunki sōm eksprymowane pod prōmotorym indukujōncym ôd galaktozy i kōnstytutywnym markerym ERES. W ekstrymalnyj tymperaturze (37°C), skuli tego, co mutacyjo sec31-1 wpływo na funkcyjo skłodnika powłoki COPII Sec31, coby hamować kełkowanie COPII i eksport ER, nowo zsyntetyzowany ładunek grōmadzi sie w ER (23). Po ôchłodzyniu do niskij tymperatury (24°C) zmutowane kōmōrki sec31-1 ôdzyskały sie z ôbszaru sekrecyjnego, a zgrōmadzōny nowy syntytyczny ładunek zaczōn być eksportowany z ER. Wizualizacyjo CLIM pokozała, iże wiynkszość nowo zsyntetyzowanych Gas1-GFP i Mid2-iRFP durch grōmadziyła sie w ER zmutowanych kōmōrek sec31-1 po inkubacyji w tymperaturze 37°C, a potym uwolniano w tymperaturze 24°C bez 5 minut (Figura 1). Pōniywoż Mid2-iRFP je porozkłodany na cołkij błōnie ER, a Gas1-GFP je skōncyntrowany i grōmadzōny na przerywnyj przestrzyństwie błōny ER, jejich porozkłodanie je do kōńca inksze (Figura 1, ôd A do C i Movie S1). Ôkrōm tego, jak pokozano na figurze 1D, klaster Gas1-GFP niy mo Mid2-iRFP. Te wyniki wskazujōm, iże GPI-AP i biōłtka transbłōnnowe były wczas roztajlowane na roztōmajte regiōny błōny ER. Klaster Gas1-GFP je prziległy do ​​specyficznego ERES ôznakowanego biōłtkym ôbtoczki COPII mCherry'ego Sec13 (Figura 1, E i F, jak tyż film S1) (23).
Kōmōrki sec31-1 eksprymujōm sekrecje indukowane bez galaktoza, ceramid dugigo lyńcucha acylowego (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zielōny) i transbłōnnowe biōłtko Mid2-iRFP (TMP, błynkitny), a to kōnstruktywne ôznakowanie ERES Sec13-mCherry (30) minut, przeniesiōny na 24°C, i ôdtworzōny bez SCLIM 5 minut niyskorzij. (A do C) pokozuje reprezyntatywny połōnczōny abo pojedynczy ôbraz 2D płaszczyzny (A), ôbraz projekcyjny 2D 10 przekrojōw z (B) abo ôbraz 3D pōłkule kōmōrkowyj markerōw ładunku i ERES (C). Skala 1μm (A i B). Jednostka skale wynosi 0,551μm (C). Gas1-GFP bōł wykryty w dyskretnych regiōnach abo skupiskach ER, w czasie kej Mid2-iRFP bōł wykryty i porozkłodany na cołkij błōnie ER (C). (D) Wykres pokozuje zglyndno intynsywność fluorescyncyje Gas1-GFP i Mid2-iRFP we klastrze Gas1-GFP wzduż linije biołyj strzałki (po lewyj). AU, arbitralno jednotka. (E i F) reprezyntujōm ôbraz 3D, co łōnczy ze sobōm towor i znak ERES. Klastry Gas1-GFP były wykryte w bliżu specyficznego ERES. Jednostka skale wynosi 0,551μm. (F) Bioło stało strzałka ôznaczo klaster Gas1-GFP zwiōnzany z ERES. Strzodkowy i prawy panel pokozujōm połōnczōny powiynkszōny ôbraz 3D i ôbrōcōny widok ôbranego klastra Gas1-GFP.
Bliski zwiōnzek przestrzynny miyndzy klastrōm Gas1-GFP a ôkryślōnym ERES wskozuje, iże Gas1-GFP może wejść do selektywnego ERES, co je inksze ôd selektywności używanyj bez Mid2-iRFP do ôpuszczynio ER. Coby ôdpowiedzieć na ta możebność, ôkryślyli my stosunek ERES ino do jednego abo dwōch toworōw (Figura 2, ôd A do C). Wykozali my, iże wiynkszość ERES (70%) zawiyro ino jedna zorta ładunku. Spodni ôbraz na figurze 2C pokozuje dwa typowe przikłady ERES z ino Gas1-GFP (Figura 1) abo ino Mid2-iRFP (Figura 2). W przeciwiyństwie do tego, kole 20% ERES zawiyro dwa ładunki, kere nakłodajōm sie na tym samym przestrzyństwie. Wykozało sie, iże niykere ERES (10%) zawiyrały dwie zorty ładunku, ale były ône wyizolowane na klarownie roztōmajtych ôbszarach. Bez to ta statystyczno analiza pokozuje, iże po eksportie ER GPI-AP Gas1-GFP i transbłōnnowy ładunek Mid2-iRFP sōm potajlowane na roztōmajte ERES (Figura 2D). Ta wydajność zortowanio je barzo zgodliwo z piyrwyjszōm analizōm biochymicznōm (6) i determinacyjōm morfologicznōm (7). Możemy tyż zaôbserwować zachowanie ładunku w kwarantannie, kery wchodzi do ERES (Figura 2E i Film S2). Figura 2E pokozuje, iże ino niywielgo tajla Gas1-GFP (panel 3) abo Mid2-iRFP (panel 4) wchodzi do ERES z jednyj strōny i je ôgraniczōno w dyskretnym przestrzyństwie. Panel 5 na figurze 2E pokozuje, iże Gas1-GFP i Mid2-iRFP sōm czasami znojdziōne w tym samym ERES, ale wchodzōm z roztōmajtych zajtōw i sōm skōncetrowane w ôsobnych regiōnach, kere mogōm reprezyntować roztōmajte pęcherzyki COPII. Potwierdziyli my tyż, iże ôbserwowano separacyjo i klasyfikacyjo GPI-AP Gas1 ôpartego na ceramidzie C26 jako selektywny ERES je specyficzno, pōniywoż inkszy transbłōnnowy ładunek sekrecje, biōłtko błōny plazmatycznyj znaczōne GFP Axl2 (27 ), wykazuje podobne zachowanie do Mid2-iRFP. (Ôbraz S1 i Film S3). Nowo zsyntetyzowany Axl2-GFP je porozkłodany bez błōna ER, jak Mid2-iRFP (Figura S1, A i B), i je spōłlokalizowany z Mid2-iRFP we wiynkszości ERES (Figura S1, B do D). Panely 1 i 2 na figurze 1. S1C pokozuje dwa typowe przikłady ERES, kaj dwa transbłōnnowe ładunki nakłodajōm sie na siebie. W takich przipadkach ôba towory wejdōm do ERES razym (Figura S1E, Panel 3 i Film S3).
Kōmōrki sec31-1 eksprymujōnce sekrecje indukowalne galaktozy, Gas1-GFP (GPI-AP, zielōny) i Mid2-iRFP (TMP, modro) jak tyż kōnstytutywne ERES ôznakujōnce Sec13-mCherry (ERES, purpurowy) były wrażane w tymperaturze 37 Po inkubacyji do °C bez 30 minut uwolniynio. blok, i ôbraz ze SCLIM po 20 minutach. (A do C) Reprezentatywne ôbrazy projekcyje 2D (A; słupek skale, 1μm) abo ôbrazy pōłkule kōmōrkowyj 3D (B i C; jednotka skale, 0,456μm) ładunku i 10 przekrojōw z ôznaczōnych bez ERES. Spodni panel w (B) i panel w (C) pokozujōm przetworzōne ôbrazy, coby pokozać ino towory ôbecne w ERES (purpur) [Gas1-GFP (szaro) i Mid2-iRFP (jasnobłynkitny)]. (C) Ôdewrzōno strzałka: ERES przenosi ino jedyn ładunek (ôd 1 do 4). Szaro strzałka: ERES zawiyro segregowany ładunek (5). Bioło strzała: ERES zawiyrajōncy spōłlokalizowany ładunek. Pōniżyj: Wybrany pojedynczy ERES zawiyro ino Gas1-GFP (1) abo Mid2-iRFP (2). Paska skale, 100 nm. (D) Kwantyfikacyjo fotomikrografu ôpisanego w (C). Strzedni procynt ERES, co zawiyro ino jedyn ładunek (Gas1-GFP abo Mid2-iRFP), segregowany ładunek i nakłodajōncy sie na siebie ładunek. W trzech niyznoleżnych eksperymyntach, n=432 w 54 kōmōrkach. Paska błyndu = SD. Dwustronny niysparowany test t. *** P = 0,0002. (E) Ôbraz 3D ôbranego ERES ładunku pod kwarantanniōm ôznaczōnego (C). Gas1-GFP (zielōny) (3) abo Mid2-iRFP (modro) (4) wchodzi do ERES (purpurny) z jednyj strōny i je ôgraniczōny do niywielgigo ôbszaru we ôbrymbie ERES. Czasami ôbie zorty ładunku wchodzōm do tego samego ERES (5) z tyj samyj zajty i sōm ôgraniczōne do ôdizolowanego przestrzyństwa we ôbrymbie ERES. Paska skale, 100 nm.
Dalij testowali my hipoteza, iże ceramid dugigo lyńcucha acylowego (C26) wystympujōncy we błōnie ER napyndza specyficzne klastrowanie i zortowanie Gas1 do selektywnego ERES. W tym cylu użyliśmy zmodyfikowanego szczypu drōżdży GhLag1, w kerym dwie endogynne syntazy ceramidowe Lag1 i Lac1 były zastōmpiōne ôd GhLag1 (hōmōlog Lag1 bawołny), co skutkowało szczypym drōżdży ze błōnōm kōmōrkowōm szczypym ceramidy krōtszy aniżeli dziko zorta (Figura 3A) (2). Analiza spektrōmetryje masowyj (MS) wykozała, iże u szczypōw dzikij zorty 95% cołkigo ceramidu je barzo dugim (C26) lyńcuchym ceramidym, w czasie kej u GhLag1 85% ceramidu je barzo dugim (C18 i C16). ), ino 2% ceramidu je ceramidym ô barzo dugim (C26) lyńcuchu. Chocioż ceramidy C18 i C16 sōm dotychczas głōwnymi ceramidami wykrytymi we błōnie GhLag1, analiza MS potwierdziyła tyż, iże kotwa GPI Gas1-GFP eksprymōwanego we szczypie GhLag1 zawiyro ceramid C26, kery je porōwnowalny do lipidōw dzikij zorty. Jakość je ta sama (ryc. 3A) (26). Bezto ôznaczo to, iże ynzym remodelujōncy ceramidy Cwh43 je barzo selektywny do ceramidu C26, jak pokozano na figurze 26, ôn preferyncyjnie włōnczo kotwa GPI z niywielgij wielości ceramidu C26 we szczypie GhLag1. S2 (29). Niymynij jednak błōna kōmōrkowo GhLag1 zaôbycz zawiyro ino ceramid C18-C16, w czasie kej Gas1-GFP durch mo ceramid C26. Tyn fakt czyni tyn szczyp idealnym norzyńdziym do kōnkretnego rozwiōnzowanio problymu dugości lyńcucha acylowego ceramidu błōnnowego w ER. Hipotytyczno rola klasy i zortowanio. Potym nojprzōd podszukowali my zdolność C26 Gas1-GFP do akumulacyje we skupiskach w GhLag1 z zmutowanym allelym sec31-1 wrażliwym na tymperatura bez kōnwyncjōnalno mikroskopijo fluorescyncyjno, kaj ino dugi (C18-C16) lyńcuch istnieje w ceramide błōny ER (fig. 3). Zaôbserwowali my, iże w sec31-1 wiynkszość Gas1-GFP była skupiōno we skupiskach, w czasie kej Gas1-GFP w sec31-1 GhLag1 z dugōm (C18-C16) dugōm ceramidowōm błōnōm ER niy była głownie skupiōno i porozkłodano we cołkij błōnie ER. Coby być akuratnymi, pōniywoż klastrowanie ôparte na ceramidach C26 je ściśle zwiōnzane ze specyficznym ERES (Figura 1), dalij podszukowali my, eli tyn proces może tyż ôbyjmować funkcyjo mechanizmu eksportowego biōłtka ER. GPI-AP używo ekstra systymu COPII do eksportu ER, kery je aktywnie sztalowany bez strukturalne remodelowanie czynści glikanowyj kotwy GPI bez Ted1 (30, 31). Rekōmbinowany GPI-glikan je potym poznany bez transbłōnnowy kōmpleks receptora ładunku p24, kery za to selektywnie rekrutuje Lst1, kery je specyficznōm izoformōm głōwnyj podjednostki wiōnżōncyj ładunek COPII Sec24, tworzōnc COPII Vesicles are necessary (33). Bez to skōnstruowali my podwōjny mutant, co połōnczył delecyjo tych pojedynczych biōłtek (skłodnik kōmpleksu p24 Emp24, ynzym remodelujōncy GPI-glikan Ted1 i specyficzno podjednostka COPII Lst1) ze mutantnym szczypym sec31-1 i podszukowali je Je możliwe utworzynie GFP1-clu3). Zaôbserwowali my, iże w sec31-1emp24Δ i sec31-1ted1Δ Gas1-GFP je głōwnie niyzgrōmadzōny i porozkłodany na cołkij błōnie ER, jak wczasnij widziano w sec31-1 GhLag1, w czasie kej w sec31-1lst1Δ Gas1-GFP1 Podobnie jak sec3. Te wyniki wskazujōm, iże ôkrōm ôbecności ceramidu C26 we błōnie ER, klasterowanie Gas1-GFP musi tyż łōnczyć sie z kōmpleksym p24 i niy wymogo specyficznyj rekrutacyje Lst1. Potym zbadali my możliwość, iże dugość lyńcucha ceramidu we błōnie ER może sztalować wiōnzanie Gas1-GFP z p24. Jednak wykozali my, iże ôbecność ceramidu C18-C16 we błōnie niy wpływo na GPI-glikany zrekōnstruowane bez kōmpleks p24 (Figurki S3 i S4, A i B) ani na wiōnzanie sie z GPI-AP i eksportowanie GPI-AP. kōnszt. Rekrutować podtyp COPII Lst1 (Figura S4C). Beztōż klastrowanie znoleżne ôd ceramidu C26 niy wymogo interakcyjōw biōłtek z roztōmajtymi mechanizmami eksportu biōłtek ER, ale spiyro alternatywny mechanizm zortowanio napyndzany dugościōm lipidōw. Potym przeanalizowali my, eli dugość lyńcucha acylowego ceramidowego we błōnie ER je wożno do skutecznyj klasyfikacyje Gas1-GFP jako selektywnego ERES. Pōniywoż Gas1 we szczypie GhLag1 z ceramidym ô krōtkim lyńcuchu ôpuszczo ER i wchodzi do błōny plazmatycznyj (Figura S5), wierzymy, iże jeźli zortowanie je napyndzane dugościōm lyńcucha acylowego ceramidu, Gas1 we szczypie GhLag1 może być przekerowany i skrziżowany. Towory ERES z tōm samōm mymbranōm.
(A) Błōna kōmōrkowo GhLag1 zawiyro głownie krōtsze ceramidy C18-C16, w czasie kej kotwa GPI Gas1-GFP durch mo taki sōm C26 IPC jak kōmōrki dzikij zorty. Powyżyj: analiza dugości lyńcucha acylowego ceramidu we błōnie kōmōrkowyj szczypōw dzikij zorty (Wt) i GhLag1p bez spektrōmetryjo masowo (MS). Dane reprezyntujōm procynt cołkigo ceramidu. Strzednio ze trzech niyznoleżnych eksperymyntōw. Paska błyndu = SD. Dwustronny niysparowany test t. **** P <0,0001. Spodni paneł: analiza MS dugości lyńcucha acylowego IPC ôbecnego w kotwie GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) eksprymōwanyj we szczypach dzikij zorty i GhLag1p. Dane reprezyntujōm procynt cołkigo sygnału IPC. Strzednio ôd piyńciu niyznoleżnych eksperymyntōw. Paska błyndu = SD. Dwustronny niysparowany test t. ns, niy ważne. P = 0,9134. (B) Mikrografy fluorescyncyjne kōmōrek sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ i sec31-1lst1Δ eksprymujōncych indukowany galaktozōm Gas1-GFP były inkubowane w tymperaturze 37°C bez minuta. po 24°C. Bioło strzałka: skupiska ER Gas1-GFP. Ôdewrzōno strzałka: Niysklustrowany Gas1-GFP je porozkłodany na cołkij błōnie ER, co pokozuje karakterystyczne farbiynie piestrzynia jōndrowego do ER. Barka skale, 5μm. (C) Kwantyfikacyjo fotomikrografu ôpisanego w (B). Strzedni procynt kōmōrek ô punktowanyj strukturze Gas1-GFP. W trzech niyznoleżnych eksperymyntach n≥300 kōmōrek. Paska błyndu = SD. Dwustronny niysparowany test t. **** P <0,0001.
Coby bezpostrzednio rozwiōnzać tyn problym, przekludziyli my wizualizacyjo SCLIM Gas1-GFP i Mid2-iRFP w GhLag1 ze mutantnym allelym sec31-1 wrażliwym na tymperatura (Figura 4 i Film S4). Po tym, jak ER bōł utrzimany w tymperaturze 37°C, a niyskorzij uwolniōny w tymperaturze 24°C, wiynkszość nowo zsyntetyzowanego Gas1-GFP niy była skupiōno i porozkłodano na cołkij błōnie ER, jak zaôbserwowano bez kōnwyncjōnalne mikroskopy (Figura 4, A i B ). Ôkrōm tego srogi procynt ERES (67%) ôbyjmuje dwie zorty ładunku, kere sōm w nim spōłlokalizowane (Figura 4D). Panele 1 i 2 na figurze 4C pokozujōm dwa typowe przikłady ERES z nakłodajōncymi sie Gas1-GFP i Mid2-GFP. Ôkrōm tego ôba towory były rekrutowane do tego samego ERES (Figura 4E, paneł 3 i film S4). Bezto nasze wyniki wskazujōm, iże dugość lyńcucha acylowego ceramidowego we błōnie ER je wożnōm determinantōm agregacyje i klasyfikacyje biōłtek ER.
Kōmōrki Sec31-1 GhLag1 eksprymujōnce sekrecje indukowane ôd galaktozy, Gas1-GFP (GPI-AP, zielōny) i Mid2-iRFP (TMP, modro) jak tyż kōnstytutywny Sec13-mCherry znakowany ERES (ERES, purpurowy) inkubujōm w tymperaturze 37°C. Kōntynuuj bez 30 minut, ôpuszczaj do 24°C, coby uwolnić wydzielynia, a po 20 minutach ôbrazuj ze pōmocōm SCLIM. (A do C) Reprezentatywne ôbrazy projekcyje 2D (A; słupek skale, 1μm) abo ôbrazy pōłkule kōmōrkowyj 3D (B i C; jednotka skale, 0,45μm) z 10 przekrojōw z ôznaczōnych cargo i ERES. Spodni panel w (B) i panel w (C) pokozujōm przetworzōne ôbrazy, coby pokozać ino towory ôbecne w ERES (purpur) [Gas1-GFP (szaro) i Mid2-iRFP (jasnobłynkitny)]. (C) Bioło wypołniōno strzała: ERES, towory nakłodajōm sie. Ôdewrzōno strzałka: ERES zawiyro ino jedyn elymynt. Spodni paneł: Wybrany ERES mo nakłodajōnce sie towory (1 i 2) ôznaczōne w (C). Paska skale, 100 nm. (D) Kwantyfikacyjo fotomikrografu ôpisanego w (C). W jednotkach sec31-1 i sec31-1 GhLag1 je włōnczōny ino jedyn ładunek (Gas1-GFP abo Mid2-iRFP), jak tyż strzedni procynt ERES dlo izolowanego ładunku i nakłodajōncego sie ładunku. W trzech niyznoleżnych eksperymyntach n = 432 w 54 kōmōrkach (sek31-1) i n = 430 w 47 kōmōrkach (sek31-1 GhLag1). Paska błyndu = SD. Dwustronny niysparowany test t. *** P = 0,0002 (sek31-1) i ** P = 0,0031 (sek31-1 GhLag1). (E) Ôbraz 3D ôbranego ERES z nakłodajōncym sie ładunkiym (3) ôznaczōnym w (C). Gas1-GFP (zielōny) i Mid2-iRFP (modro) zbliżajōm sie do ERES (purpurny) z tyj samyj zajty i ôstowajōm na tym samym ôgraniczōnym przestrzyństwie ERES. Paska skale, 100 nm.
To podszukowanie dostarczo bezpostrzednich dowodōw in vivo na to, iże ładunki biōłtek ôparte na lipidach sōm klasyfikowane na selektywne miyjsca eksportu na sztrece sekretoryjnyj i ujawnio znaczynie dugości lyńcucha acylowego do selektywności klasyfikacyje. Przi użyciu potynżnyj i nojnowocześniyjszyj techniki mikroskopije zwanyj SCLIM, wykozali my nowo zsyntetyzowany Gas1-GFP (głowny błōny plazmatyczny GPI-AP z barzo dugim lyńcuchym acylowym (C26) tajlōm lipidōw biōłtka) we drōżdżach ) Regiōny skupiōne w dyskretnych specyficznych transbłōnach ER, sōm powiōnzane ze sekretnymi ER. błōna ER (Figura 1). Ôkrōm tego te dwie zorty toworōw wchodzōm selektywnie do roztōmajtych ERES (Figura 2). Dugość lyńcucha acylowego ceramidu kōmōrkowego we błōnie je zmyńszōno z C26 do C18-C16, klaster Gas1-GFP je przekroczōny w dyskretny regiōn ER, a Gas1-GFP je przekierowany, coby ôpuścić ER z biōłtkym transbłōnnowym bez tyn sōm ERES (Figura 3 i Figura 3). 4).
Chocioż GPI-AP używo wyspecjalizowanego mechanizmu biōłtkowego do wyjścio z ER, wykozali my, iże separacyjo znoleżno ôd ceramidu C26 niy polygo na rōżnicowych interakcyjach biōłtkowych, kere mogōm kludzić do specjalizacyje ERES (Figurki S4 i S5). Zamiast tego, nasze ôdkrycia potwierdzajōm alternatywny mechanizm klasyfikacyje napyndzany bez klasterowanie biōłtek ôpartych na lipidach i niyskorsze wykluczynie inkszych ładunkōw. Nasze ôbserwacyje wskazujōm, iże regiōn abo klaster Gas1-GFP zwiōnzany ze specyficznym ERES brakuje transbłōnnowego wydzielanego biōłtka Mid2-iRFP, co wskazuje, iże klaster GPI-AP znoleżny ôd ceramidu C26 ułacni jejich wchodzynie do ôdpednigo ERES, a we tym samym czasie wykluczy tyn kōnkretny transbłōnny (Fig. 2). W przeciwiyństwie do tego, ôbecność ceramidōw C18-C16 we błōnie ER niy powoduje tworzynio regiōnōw abo skupisk GPI-AP, bezto niy wykluczajōm ani niy zastympujōm transbłōnnowych wydzielanych biōłtek w tym samym ERES (Figurki 3 i 4). . Bezto propōnujemy, coby ceramid C26 napyndzał separacyjo i klasyfikacyjo bez ułacnianie klastrowanio biōłtek połōnczōnych ze ôkryślōnymi ERES.
Jak ôsiōngnōńć to klasterowanie znoleżne ôd ceramidu C26 w ôkryślōny ôbszar ER? Tyndyncyjo ceramidu błōnnowego do rozdzielanio sie bocznie może sprawić, iże ceramidy GPI-AP i C26 tworzōm małe i niyzawodnie uporzōndkowane lipidy w barzij niyregularnym strzodowisku lipidowym błōny ER zawiyrajōncym krōtsze i niynasycōne glicerolipidy. Klastry jakości (17, 18). Te małe tymczasowe skupiska mogōm być dalij łōnczōne we srogsze, barzij sztabilne skupiska po łōnczyniu sie z kōmpleksym p24 (34). Zgodnie z tym, wykozali my, iże C26 Gas1-GFP musi wchodzić w interakcyjo z kōmpleksym p24, coby tworzić srogsze widzialne skupiska (Figura 3). Kōmpleks p24 je heterozygotycznym ôligomerym skłodajōncym sie ze sztyrech roztōmajtych biōłtek transbłōnnowych p24 we drōżdżach (35), kere zapewnio wielowertowe wiōnzanie, kere może kludzić do sieciōwanio małych skupisk GPI-AP, generujōnc w tyn spōsōb srogszy klaster Stable (34). Interakcyjo miyndzy ektodōmynami biōłtkowymi GPI-AP może tyż prziczyniać sie do jejich agregacyje, jak pokozano w czasie jejich transportu Golgigo we spolaryzowanych kōmōrkach epitelialnych ôd ssakōw (36). Jednak kej ceramid C18-C16 je ôbecny we błōnie ER, kej kōmpleks p24 łōnczy sie z Gas1-GFP, niy powstowajōm sroge ôsobne skupiska. Bazowy mechanizm może zależeć ôd specyficznych włosności fizycznych i chymicznych ceramidu z dugim lyńcuchym acylowym. Biofizyczne badania sztucznych błōnōw pokozujōm, iże chocioż tak duge (C24), jak i krōtke (C18-C16) ceramidy lyńcucha acylowego mogōm powodować rozdzielynie faz, ino ceramidy dugich lyńcuchōw acylowych (C24) mogōm prōmować wysoke zakrziwiynie i zygniyńcie filmu, coby pōmiynić forma filmu. Bez wzajymne ôdniesiynie (17, 37, 38). Wykozano, iże transbłōnnowo helisa TMED2, ludzkigo hōmōlogu Emp24, selektywnie wchodzi w interakcyjo ze sfingomielinōm ôpartōm na ceramidzie C18 we płatkach cytōmplazmatycznych (39). Przi użyciu symulacyje dynamiki molekularnyj (MD), wykozali my, iże tak ceramidy C18, jak i C26 grōmadzōm sie naôbkoło płatkōw cytōmplazmatycznych helisy transbłōnnowyj Emp24 i majōm podobne preferyncyje (Figura S6). Warto zauważyć, iże wskazuje to, iże transbłōnnowo helisa Emp24 może kludzić do asymetrycznego porozkłodanio lipidōw we błōnie. Je to niydowny wynik ôparty na kōmōrkach ôd ssakōw. Podobne symulacyje MD pokozujōm tyż ôbecność lipidōw eteru (40) . Bez to spekulujymy, iże ceramid C26 w dwōch płatkach ER26 je lokalnie zbogacōny. Kej GPI-AP w płatkach luminalnych dyrekt łōnczy sie z wielowartościowym p24 i akumulacyjōm ceramidu C26 naôbkoło p24 w płatkach cytōmplazmatycznych, może to prōmować towarzyszōnco agregacyjo biōłtek i zakrziwiōne błōny sōm gynerowane bez palce (41), co powoduje, iże GPI-AP rozdzielo sie tyż na wysoki regiōn dyskre. regiōnōw błōny ER (42). Piyrwyjsze raporty spiyrały propōnowany mechanizm (43, 44). Wielowartościowe wiōnzanie ôligolektynōw, patogynōw abo przeciwciał z glikosfingolipidami ôpartymi na ceramidach (GSL) na błōnie plazmatycznyj wywołuje srogo agregacyjo GSL, zwiynkszo separacyjo faz i powoduje deformacyjo i internalizacyjo błōny (44). Iwabuchi itp. (43) Wykozano, iże w ôbecności dugich (C24), ale niy krōtkich (C16) lyńcuchōw acylowych, wielowartościowy ligand zwiōnzany z laktosylceramidym GSL indukowoł tworzynie sie srogich skupisk i inwaginacyjo błōnōw, a transdukcyjo sygnału pośredniczōno bez cytōmplazma Lyn w chagitropylowych listkach je interakylowo.
W polaryzowanych kōmōrkach epitelialnych ôd ssakōw kōncyntracyjo necu anty-Golgigo (TGN) na poziōmie apikalnyj błōny plazmatycznyj kōntroluje separacyjo i zortowanie GPI-AP (10, 45). Ta agregacyjo je napyndzano bez ôligomeryzacyjo GPI-AP (36), ale może tyż zależeć ôd dugości lyńcucha ceramidōw, jaki znojdujymy we drōżdżach. Chocioż GPI-AP ôd ssakōw mo kotwa ôparto na eterze lipidami, a jego struktura chymiczno je barzo inkszŏ ôd ceramidu z barzo dugim lyńcuchym acylowym, niydowne badania wykozały, iże ôba lipidy majōm ewolucyjnie podobne włosności fizyczne i chymiczne i funkcyje (40). Beztōż czynść lipidowo eteru w kōmōrkach ôd ssakōw może być podobno do ceramidu C26 we drōżdżach, a jeji rolōm je powiōnzanie sie z ceramidym ô dugim lyńcuchu we błōnie, coby prōmować agregacyjo i zortowanie GPI-AP. Chocioż ta możliwość durch musi być dyrekt testowano, piyrwyjsze wyniki potwierdzajōm, iże transport ceramidu dugigo lyńcucha acylowego do ciała Golgigo niy je przekludzany bez cytōmplazmatyczne biōłtka transferowe, ale zależy ôd syntezy kotwōw GPI, takich jak drōżdże. Bezto ewolucyjny kōnserwatywny mechanizm zdowo sie być w sztańdzie selektywnie spōłtransportować barzo dugi lyńcuch acylowy ceramid i GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) w tym samym pęcherzyku transportowym.
W spolaryzowanych układach kōmōrkowych epitelialnych drōżdży i ssakōw agregacyjo GPI-AP i separacyjo ôd inkszych biōłtek błōny plazmatycznyj zachodzi przed ôsiōngniyńciym powiyrchnie kōmōrkowyj. Paladino i inksi. (48) wykozały, iże na TGN polaryzowanych kōmōrek epitelialnych ôd ssakōw klastrowanie GPI-AP je niy ino kōnieczne do selektywnyj klasyfikacyje GPI-AP do apikalnyj błōny plazmatycznyj, ale tyż sztaluje klastrowanie ôrganizacyje GPI-AP i jejich aktywność biologiczno. Powiyrchnia kōmōrki. W drōżdżach to podszukowanie wykozało, iże klaster GPI-AP znoleżny ôd ceramidu C26 na ER może sztalować ôrganizacyjo klastra i funkcjōnalno aktywność GPI-AP na błōnie plazmatycznyj (24, 49). Zgodnie z tym modelym, kōmōrki GhLag1 sōm ulergiczne na inhibitory GPI abo lyki, kere wpływajōm na integralność ścian kōmōrkowych (28), a potrzeba funkcjōnalnych skupisk Gas1-GFP (49) ceramidu kōńcowego rzutowanego w łōnczyniu kōmōrek drōżdży wskozuje na G Możliwe kōnsekwyncyje fizjologiczne kōmōrek hLag1. Błōnd GPI-AP. Jednak dalsze badania, eli funkcjōnalno ôrganizacyjo powiyrchnie kōmōrkowyj była zaprogramowano z ER metodōm zortowanio ôpartōm na dugości lipidōw, bydōm przedmiotym naszych prziszłych podszukowań.
Szczepy Saccharomyces cerevisiae używane w tyj robocie sōm wymiyniōne w tabeli S1. Szczepy MMY1583 i MMY1635 SCLIM do ôbrazowanio żywych kōmōrek były skōnstruowane na tle W303. Te szczypy eksprymujōnce Sec13-mCherry z fluorescyncyjnym znakiym biōłtka były skōnstruowane ze użyciym metody ôpartyj na ryakcyji lyńcuchowyj polimerazy (PCR) z plazmidym pFA6a za muster (23). Szczep eksprymujōncy Mid2-iRFP ôznakowany fluorescyncyjnym biōłtkym pod kōntrolōm prōmotora GAL1 bōł skōnstruowany w nastympujōncy spōsōb. Amplifikacyjo PCR sekwyncyje iRFP-KanMx z wektora pKTiRFP-KAN (dar ôd E. O'Shea, numer plazmidu Addgene 64687; Po zmocniyniu i sklōnowaniu sekwyncyje gynōmu Mid2-iRFP do prōmotora GAL1, ôna była zintegrowano w miyjscu Not I-Sac I plazmidu integracyjnego pRS306. Powstały plazmid pRGS7 bōł lynijowy z Pst I, coby zintegrować sie z locus URA3.
Gyn fuzyjny Gas1-GFP je eksprymōwany pod kōntrolōm prōmotora GAL1 we plazmidzie cyntrōmeru (CEN), co je kōnstruowany w nastympujōncy spōsōb. Sekwyncyjo Gas1-GFP była zmocniōno ze pōmocōm PCR z plazmidu pRS416-GAS1-GFP (24) (dar ôd L. Popolo) i sklōnowano w miyjscu Xma I-Xho I plazmidu CEN pBEVY-GL LEU2 (dar ôd C) . Miller; Numer plazmidu przidajnego 51225; 51225; RRID: Przidajnik_51225). Powstały plazmid bōł nazwany pRGS6. Gyn fuzyjny Axl2-GFP je tyż eksprymōwany pod kōntrolōm prōmotora GAL1 wektora pBEVY-GL LEU2, a jego kōnstrukcyjo je nastympujōnco. Sekwyncyjo Axl2-GFP była zmocniōno z plazmidu pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ze pōmocōm PCR i sklōnowano do miyjsca Bam HI-Pst I wektora LEU2 pBEVY-GL. Powstały plazmid bōł nazwany pRGS12. Sekwyncyjo ôligōnukleotydōw użytych w tym badaniu je wymianowano w tabeli S2.
Szczyp bōł dopołniōny 0,2% adyninōm i 2% glukozōm [YP-dekstrozōm (YPD)], 2% rafinozōm [YP-rafinozōm] bogatym w ekstrakt drōżdży biōłtka p (YP) ôstrzodkym (1 % ekstraktu drōżdży i 2% biōłtka ept). (YPR)] abo 2% galaktozy [YP-galaktoza (YPG)] jako zdrzōdło wōnglo, abo w syntytycznym minimalnym ôstrzodku (0,15% zasady azotu drōżdży i 0,5% siarczanu amōniu) do uzupełniynio ôdpednich aminokwasōw i zasad przidajnych do żywiynio , I zawiyrajōncym 2% ôstrzodka syntetyczno minimalno glukoza2) (syntytyczne minimalne ôstrzodek galaktozy) jako zdrzōdło wōnglo.
W przipadku ôbrazowanio w czasie rzeczywistym, wrażliwe na tymperatura kōmōrki mutantne sec31-1, co eksprymujōm kōnstrukt pod prōmotorym GAL1, były chowane we ôstrzodku YPR w tymperaturze 24°C bez noc do fazy strzednij log. Po indukcyji w YPG w tymperaturze 24°C bez 1 godzina, kōmōrki były inkubowane w SG w tymperaturze 37°C bez 30 minut, a potym przeniesiōne do 24°C, coby uwolnić z bloku sekrecje. Kōnkanawalina A była użyto do utrwalynio kōmōrek na szklanyj ôbłoczce i ôdtworzōno ze pōmocōm SCLIM. SCLIM to połōnczynie ôdwrōcōnego mikroskopu fluorescyncyjnego Olympus IX-71 i ôbiektywu ôlejowego z numerycznōm ôtworōm UPlanSApo (Olympus), gibkigo i wysokigo relacyje sygnału do szumu ôbrotowego dyskowego skanera kōnfokalnego (Yokogawa Electric i niysztandardowego spektrōmetra ôbrazu (Fōtōnika Hamamatsu) może zapewnić systym powiynkszajōncych ôbiektywōw ô ôstatecznym powiynkszyniu ×266,7 jak tyż kamera masziny sprzyngniyntyj ze ładunkiym, co mnoży elektrōny (Fōtōnika Hamamatsu) (21). Pozyskowanie ôbrazōw je wykōnowane ze pōmocōm niestandardowego ôprogramowanio (Yokogawa Electric). W przipadku ôbrazōw 3D użyli my siyłownika piezoelektrycznego wykōnanego na zamówienie, coby dyrgać ôbiektywōm piōnowo i zebrali my czynści ôptyczne we ôdległości 100 nm we stosie. Ôbraz stosu Z je przekształcany w dane wokselowe 3D, a teoretyczno funkcyjo rozprzestrzynianio pōnktōw używano do ôbrotowego mikroskopu kōnfokalnego dysku je używano do przetworzanio dekōnwolucyje bez ôprogramowanie Volocity (PerkinElmer). Bez użycie ôprogramowanio Volocity do autōmatycznego ôkryślynio progu analizy kolokalizacyje, zmierzōno ERES w tym ładunek. Analiza skanowanio linije była przekludzōno ze użyciym ôprogramowanio MetaMorph (Molecular Devices).
Użyj ôprogramowanio GraphPad Prism do ôkryślynio statystycznyj znaczynio. W przipadku dwustronnego testu t ôd Studynta i zwykłego testu jednodrōżnyj analizy wariancyje (ANOVA) uwożo sie, iże rōżnice miyndzy grupami majōm znaczōncy wpływ na P <0,05 (*).
W przipadku fluorescyncyjnyj mikroskopije Gas1-GFP, kōmōrki fazy log były chowane bez noc w YPD i zebrane bez ôdwirowanie, przemywane dwa razy fosforanowo buforowanōm sōlnōm wodōm i inkubowane na lodzie bez aby 15 minut, a potym postympowane pod mikroskopym, jak ôpisano wczasnij (Check24). Do pozyskowanio bōł użyty mikroskopu Leica DMi8 (olej HCX PL APO 1003/1,40 PH3 CS) wyposażōny we ôbiektyw, filtr L5 (GFP), kamerã Hamamatsu i ôprogramowanie Application Suite X (LAS X). .
Prōbki były dynaturowane ze pōmocōm bufora prōbkowego SDS w tymperaturze 65°C bez 10 minut, a potym rozdzielōne bez elektroforeza żelowo SDS-poliakrylamidowo (PAGE). Do analizy immunoblotowanio 10 μl prōbki było załadowane na ôsi. Piyrwotne przeciwciało: Używać krōliwego poliklōnalnego anty-Gas1 w roztworzyniu 1:3000, krōliwego poliklōnalnego anty-Emp24 w roztworzyniu 1:500 i krōliwego poliklōnalnego anty-GFP (dar ôd H. Riezmana) w roztworzyniu 1:3000. Mysie mōnoklōnalne przeciwciało anty-Pgk1 było użyte w roztworzyniu 1:5000 (dar ôd J. de la Cruz). Wtōrne przeciwciało: Kozi immunoglobulina G (IgG) społōnczōno z peroksydazōm chrōnu (HRP) używano w roztworzyniu 1:3000 (Pierce). Kozie anty-mysie IgG sprzōntane z HRP było używane w roztworzyniu 1:3000 (Pierce). Strefa immunologicznyj ôdpowiedzi była ôbserwowano metodōm chymiluminescencyje ôdczynnika SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Jak ôpisano w (31), przekludzōno naturalny eksperymynt immunoprecypitacyje na zbogacōnyj frakcyji ER. Krōtko godajōnc, myć kōmōrki drōżdży bufrym TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluoru fenylometylsulfōnilu i miszōngu inhibitora proteaz) przi 600 nm ( OD600 desynsytyczny) przi 100 dwu razy. Ôna była łōmane ze pōmocōm szklanych koraliki, a potym zaniyczyszczynia kōmōrkowe i szklane koraliki były usuniynte bez ôdwirowanie. Supernatant bōł potym ôdwirowany przi 17 000 g bez 15 minut przi 4°C. Pellet bōł resuspendowany w TNE, a saponina digitalis była przidano do ôstatecznego stynżynio 1%. Suspensyjo była inkubowano bez 1 godzina z ôbrotōm w tymperaturze 4°C, a potym nierozpuszczalne skłodniki były usuwane bez ôdwirowanie przi 13 000 g w tymperaturze 4°C bez 60 minut. W przipadku immunoprecypitacyje Gas1-GFP nojprzōd wczasnij inkubować prōbka z prōżnymi koralikami agaroznymi (ChromoTek) w tymperaturze 4°C bez 1 godzina, a potym inkubować z GFP-Trap_A (ChromoTek) w tymperaturze 4°C bez 3 godziny. Immunoprecypitowane koraliki były przemywane piyńć razy TNE zawiyrajōncym 0,2% digoksygyniny, eluowane buforem prōbkowym SDS, rozdzielōne na SDS-PAGE i analizowane ze pōmocōm immunoblotowanio.
Jak ôpisano w (31), determinacyjo sieciōwo przekludzōno na zbogacōnyj frakcyji ER. Krōtko godajōnc, zbogacōno frakcyjo ER była inkubowano z 0,5 mM ditiobisym (propiōnian sukkcynimidylu) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Ryakcyjo sieciynio była zgasniynto bez przidanie glicyny (50 mM ôstatecznego stynżynio, 5 minut, 20°C).
Jak ôpisano wczasnij (50), przekludzōno była analiza MS ceramidu we szczypach dzikij zorty i GhLag1. Krōtko godajōnc, kōmōrki były chowane do fazy wykładniczyj (3 do 4 jednostek OD600/ml) w YPD w tymperaturze 30°C, a 25×107 kōmōrek było zebranych. Jejich metabolizm je haśniynty kwasym trichloroctowym. Użyć rozpuszczalnika ekstrakcyjnego [etanol, woda, eter, piridyna i 4,2 N wodorotlynku amōniu (15:15:5:1:0,018 v/v)] i 1,2 nmol wnyntrznego sztandardowego ceramidu C17 (860517, lipid polarny Avanti) jakości). Użyj ôdczynnika mōnometylaminowego [metanol, woda, n-butanol i roztwōr metylaminowy (4:3:1:5 v/v)] do przekludzynio łagodnyj alkalicznyj hydrolizy ekstraktu, a potym użycie nasycōnego wodōm n-butanolu do ôdsolynio. Yntlich ekstrakt bōł resuspendowany w rozpuszczalniku trybu pozytywnego [chloroform/metanol/woda (2:7:1) + 5 mM octan amōniu] i wstrzikniynty do spektrōmetra masowego. Wieloreakcyjne mōnitorowanie (MRM) przekludzōno do idyntyfikacyje i kwantyfikacyje czōnsteczek sfingolipidōw. Trzeciorzōndny czwartopolewy spektrōmetr masowy TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) je wyposażōny we robotyczne zdrzōdło jōnōw nanoprzepływu Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) do analizy lipidōw. Ynergijo zderzynio je zoptymalizowano dlo kożdyj kategoryje ceramidōw. Dane MS były uzyskane w trybie pozytywnym. Dlo kożdyj repliki biologicznyj sygnał lipidowy je medianōm trzech niyznoleżnych pōmior.
Jak ôpisano w (31), kōmōrki (800×107) eksprymujōnce Gas1-GFP poddano naturalnyj immunoprecypitacyji. Ôczyszczōny Gas1-GFP bōł ôddzielōny ze pōmocōm SDS-PAGE i przeniesiōny na mymbrana poliwinilidynowo fluoru (PVDF). Biōłtko było wizualizowane bez farbiynie PVDF amidowōm czornōm. Pasmo Gas1-GFP było wytniynte z PVDF i przemyte 5 razy metanolym i raz wodōm ciekłyj chrōmatografije-MS (LC-MS). Bez inkubacyjo paska błōnnowego z 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buforem i 500 μl świyżo rozpuszczōnyj 1 M miszōngu azotu sodu w tymperaturze 37°C bez 3 godziny, frakcyjo lipidowo je uwolniano z Gas1-GFP i lizowanym Uwolniyniym cerkofaolu (51). Po tym paska membranowo była przemyto sztyry razy wodōm klasy LC-MS, suszōno w tymperaturze pokojowyj i przechowowano we azotowyj atmosferze w tymperaturze -80°C do analizy. Za kōntrola do kożdego eksperymyntu użyto prōznyj prōbki błōny PVDF. Lipid pobrany z Gas1-GFP bōł potym analizowany ze pōmocōm MS, jak ôpisano (50). Krōtko godajōnc, paski PVDF zawiyrajōnce lipidy GPI były resuspendowane w 75 μl ujymnego rozpuszczalnika do pleśni [chloroform/metanol (1:2) + 5 mM octan amōniu] i przeszły jōnizacyjo elektrosprayowo (ESI)-MRM/MS analiza gatōnkōw sfingolipidōw (TSQ Vantage). W tym przipadku dane MS były uzyskane w trybie jōnōw ujymnych.
Jak spōmniano wczasnij, lipidowo tajla kotwy GPI była ôddzielōno ôd [3H]-inozytolu ôznakowanego GPI-AP (16). Lipidy były rozdzielane ze pōmocōm chrōmatografije ciynkoworsztwowyj ze użyciym systymu rozpuszczalnika (55:45:10 chloroform-metanol-0,25% KCl) i wizualizowane ze pōmocōm FLA-7000 (Fujifilm).
Kōmōrki eksprymujōnce Gas1-GFP (600×107) były przemywane dwa razy buforem TNE ze buforem TNE, i łōmane ze szklanymi koralikami, a potym ôdwirowane, coby usuniynć zanieczyszczynia kōmōrkowe i szklane koraliki. Supernatant bōł potym ôdwirowany przi 17 000 g bez 1 godzina przi 4°C. Pelet przemywano we TNE i inkubowano z 1 U PI-PLC (Invitrogen) we TNE zawiyrajōncym 0,2% saponiny digitalis bez 1 godzina w tymperaturze 37°C. Po ôbsudzeniu ynzymowym błōna była usuniynto bez ôdwirowanie przi 17 000 g w tymperaturze 4°C bez 1 godzina. Coby immunoprecypitować Gas1-GFP, supernatant bōł inkubowany z GFP-Trap_A (ChromoTek) w tymperaturze 4°C bez noc. Snożōny Gas1-GFP rozdzielōny bez SDS-PAGE bōł farbiōny błynszczōncym modrym Coomassiego. Pasmo farbiynio Gas1-GFP było ôdetniynte ôd szarości ôbtoczajōncyj akwedukt, a potym po alkilacyji jodoacetamidym i redukcyji ditiotreitolym przekludzōno trowiynie we żelu ze trypsynōm. Ekstrakcyjo i suszynie peptydōw tryptycznych i peptydōw ze pōmocōm GPI-glikanōw. Suszōny peptyd bōł rozpuszczōny w 20 μl wody. Wstrziknōńć porcyjo (8μl) do LC. Do ôddzielanio peptydōw w ôkryślōnych warōnkach gradientu użyto kolōmny oktadecylsilanowyj (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; wewnyntrzno strzednica 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, Prefektura Aichi, Japōnijo). Fazōm ruchōmōm je rozpuszczalnik A (0,08% kwasu mrōnowego) i rozpuszczalnik B (0,15% kwasu mrōnowego w 80% acetōnitrilu). Systym HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Bostōn, Massachusetts) bōł użyty do eluowanio kolōny rozpuszczalnikiym A w czasie 55 minut przi przepływie 50 μl min-1 bez 5 minut, a potym stynżynie rozpuszczalnika B było zwiynkszōne do 40%. , Stany Zjednoczōne). Eluat bōł sztyjc wkludzany do zdrzōdła jōnōw ESI, a peptydy tryptyczne i peptydy z GPI-glikanami były analizowane ze pōmocōm LTQ Orbitrap XL (hybrydowy lynijowy jōnowy spektrōmetr masowy trap-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). W ustawiyniu MS napiyńcie zdrzōdła kapilarnego było ustawiōne na 4,5 kV, a tymperatura kapilarnego transferowego utrzimowano na 300°C. Napiyńcie kapilarne i napiyńcie ôbiektywu rułki były ustawiōne ôdpednio na 15 V i 50 V. Dane MS były uzyskane w trybie jōnōw dodatnich (rozdzielczość 60 000; akuratność masowo 10 czynści na milijōn) w zakresie masy 300/m/z stosunek masa/ładōnek (m/z) 3000. Dane MS/MS sōm uzyskane bez jōnowo pułapka w XLthe Ors3 first on [ dysocjacyjo wywołano bez zderzynie (CID)].
Symulacyje MD przekludzōno ze użyciym ôprogramowanio GROMACS (52) i pola siył MARTINI 2 (53-55). Budownic błōnōw CHARMM GUI (56, 57) bōł potym użyty do kōnstruowanio podwōjnyj worsztwy zawiyrajōncyj dioleoilfosfatydylcholina (DOPC) i Cer C18 abo DOPC i Cer C26. Topologijo i spōłrzyndne Cer C26 sōm pochodzōnce z DXCE bez usuniyńcie ekstra koralikōw z ôgōna sfingozyny. Użyj procesu ôpisanego niżyj do wyrōwnoważynio dwojistyj worsztwy i wykōnanio jij, potym użyj ôstatnich wspōłrzyndnych systymu do zbudowanio systymu zawiyrajōncego Emp24. Dōmyna transbłōnnowo drōżdży Emp24 (reszty ôd 173 do 193) była skōnstruowano za α-spira ze użyciym wizualnyj struktury molekularnyj norzyńdzio MD (VMD) (58). Potym, po usuniyńciu nakłodajōncych sie na siebie lipidōw, biōłtko było grubo granulowane i wkludzōne do podwōjnyj worsztwy ze pōmocōm CHARMM GUI. Ôstateczny systym zawiyro 1202 DOPC i 302 Cer C26 abo 1197 DOPC i 295 Cer C18 i Emp24. Jōnizować systym do stynżynio 0,150M. Dlo dwōch dwuworsztwowych kōmpozycyji wykōnano sztyry niyznoleżne repliki.
Podwōjno warstwa lipidowo je wyrōwnoważōno ze pōmocōm procesu CHARMM GUI, kery ôbyjmuje minimalizowanie, a potym wyrōwnoważynie 405 000 krokōw, kaj ôgraniczenia pozycyje sōm stopniowo zmyńszane i eliminowane, a krok czasowy je zwiynkszany z 0,005 ps do 0,02 ps. Po rōwnowodze wytwarzo 6 μs z krokym czasowym 0,02 ps. Po wkludzyniu Emp24 użyj tego samego procesu CHARMM GUI do zminimalizowanio i wyrōwnoważynio systymu, a potym uruchom bez 8 s w produkcyji.
Dlo wszyskich systymōw w czasie procesu rōwnoważynio ciśniynie je kōntrolowane bez barostat Berendsena (59), a w czasie procesu produkcyje ciśniynie je kōntrolowane bez barostat Parrinello-Rahmana (60). We wszyskich przipadkach strzednie ciśniynie wynosi 1 bar, a używo sie pōł-izotropowego schymatu sprzōntanio ciśniynio. W procesie rōwnowogi i produkcyje termostat (61) z wartkościōm rekalibracyjōm je używany do sprzōntanio ôdpednio tymperatury tajleczek biōłtka, lipidōw i rozpuszczalnika. W czasie cołkij ôperacyje docylowo tymperatura wynosi 310K. Interakcyjo niywiōnżōnco je ôbliczano bez wygynerowanie wykazu parōw ze użyciym schymatu Verleta z tolerancyjōm bufora 0,005. Termin Coulomba je ôbliczany ze użyciym pola reakcyje i ôdległości ôdciyńcio 1,1 nm. Termin Vandera Waalsa używo schymatu ôdciyńcio z ôdległościōm ôdciyńcio 1,1 nm, a schymat ôdciyńcio Verleta je używany dlo potyncjołowego dryfu (62).
Przi użyciu VMD dugość wele ôdciyńcio miyndzy koralikami fosforanowymi DOPC abo koralikami ceramidycznymi AM1 a biōłtkym wynosi 0,7 nm, a ôbliczo sie liczba lipidōw, co wchodzōm w interakcyjo z biōłtkym. Podle nastympujōncego wzoru porachuj spōłczynnik deplecyje-bogacynio (DE) jak w (63): spōłczynnik DE = (wielość cołkowitych lipidōw w biōłtku 0,7) w biōłtku 0,7 (wielość Cer w cołkowitych lipidach)
Zgłoszōny wert je uzyskowany za strzednio, a słupki błyndōw to sztyry niyznoleżne kopije SE. Statystyczno znaczōncość spōłczynnika DE je ôbliczano ze pōmocōm testu t [(strzedni spōłczynnik DE-1)/SE]. Porachuj wert P z jednostronnego dystrybucyje.
Norzyńdzie GROMACS było użyte do ôbliczanio 2D karty tyngości bocznyj systymu zawiyrajōncego Emp24 w czasie ôstatnich 250 ns śladu. Coby uzyskać karta zbogacynio/poczōntkowanio ceramidu, karta tyngości Cer je podzielōno bez suma karty Cer i DOPC, a potym podzielōno bez stynżynie Cer w ciele. Używo sie tyj samyj skale karty farbōw.
Coby zapoznać sie z ekstra materyjami do tego artykułu, patrz http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1.
Je to artykuł z ôtwartym dostympym dystrybuowany na warōnkach Licyncyje Creative Commons Attribution-Non-Commercial, co przizwolo na użycie, dystrybucyjo i reprodukcyjo w leda jakim medium, podwiela ôstateczne użycie niy ma dlo kōmercyjnego zysku, a założyniym je to, iże ôryginalno robota je noleżno. Ôdniesiynie.
Napomniynie: Prosimy ino ô podanie twojigo adresu e-mail, coby ôsoba, kerõ rekōmyndujesz na strōna, wiedziała, iże chcesz, coby zoboczyła e-mail i że to niyma spam. Niy chwytamy żodnych adresōw e-mail.
To pytanie je używane do przetestowanio, eli jesteś gościym i do zapobiyganio autōmatycznymu przesyłaniu spamu.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Waleria Zoni (Waleria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope (Linero), Waga, Misako Arman, Miyako Riman, Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ôbrazowanie 3D w czasie rzeczywistym we wysokij rozdzielczości pokozuje znaczynie dugości lyńcucha ceramidōw do zortowanio biōłtek w selektywnych miyjscach wyjściowych.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Waleria Zoni (Waleria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope (Linero), Waga, Misako Arman, Miyako Riman, Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ôbrazowanie 3D w czasie rzeczywistym we wysokij rozdzielczości pokozuje znaczynie dugości lyńcucha ceramidōw do zortowanio biōłtek w selektywnych miyjscach wyjściowych.
©2020 Amerykański Stowarziszynie dlo Postympu Nauki. wszyske prawa zastrzeżōne. AAAS je partnyrym ôd HINARI, AGORI, OARE, CHORU, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. Postympy Nauki ISSN 2375-2548.