Teroźny *Teroźny adres: Kolōnia 50931, Niymce, Kolōnia Podszukowania klastrōw doskonałości nad ryakcyjōm na stres kōmōrkowy w chorobach zwiōnzanych ze starzyniym sie (CECAD).
Neurodegyneracyjo chorōb mitochōndrialnych je uwożano za niyôdwracalno, skuli tego, co plastyczność metaboliczno neurōnōw je ôgraniczōno, ale wpływ dysfunkcyje mitochōndrialnyj na autōnōmijo kōmōrkowo metabolizmu neurōnōw w ôrganizmie je słabo poznany. Tukej wkludzomy kōmōrkowo-specyficzny proteōm neurōnōw Purkinje'a z progresywnym niydostatkiym OXPHOS sprawiōnym zaburzōnōm dynamikōm fuzyje mitochōndrialnyj. Wykozali my, co dysfunkcyjo mitochōndrialno wywołała głymboko pōmiana we dōmynie proteōmiki, kero antlich dokludziyła do sekwyncyjnyj aktywacyje akuratnych programōw metabolicznych przed śmierciōm kōmōrki. Niyôczekiwanie ôkryślyliśmy ôczywisto indukcyjo karboksylazy pirogrōnianu (PCx) i inkszych ynzymōw przeciw starzyniu sie, kere uzupełniajōm postrzednie produkty cyklu TCA. Hamowanie PCx zaostrzało stres oksydacyjny i neurodegyneracyjo, co wskozuje na to, iże ateroskleroza mo ôchrōnny efekt we neurōnach pozbytych OXPHOS. Restauracyjo fuzyje mitochōndrialnyj w kōńcowo zdegynerowanych neurōnach doimyntnie ôdwroco te cychy metaboliczne, zapobiygajōnc tym samym śmierci kōmōrek. Nasze ôdkrycia idyntyfikujōm wczasnij niyznōme sztreki, kere dowajōm ôdporność na dysfunkcyjo mitochōndrialno i pokozujōm, iże neurodegyneracyjo może być ôdwrōcōno nawet w pōźnych etapach choroby.
Głōwno rola mitochōndriōw w utrzimaniu metabolizmu ynergije neurōnōw je podkryślano bez rozlygłe ôbjawy neurologiczne zwiōnzane z ludzkimi chorobami mitochōndrialnymi. Wiynkszość z tych chorōb je sprawiōno mutacyjami gynōw, kere sztalujōm ekspresyjo gynōw mitochōndrialnych (1, 2) abo destrukcyjōm gynōw zwiōnzanymi z dynamikōm mitochōndrialnōm, kere postrzednio wpływajōm na stabilność mitochōndrialnego DNA (mtDNA) (3, 4). Robota na modelach zwierzyncych wykozała, iże w ôdpowiedzi na dysfunkcyjo mitochōndrialno w ôbtoczajōncych tkankach idzie aktywować kōnserwatywne szlaki metaboliczne (5-7), co dostarczo wożnych informacyjōw do głymbokigo zrozumiynio patogynezy tych słożōnych chorōb. W klarownym przeciwiyństwie do tego, nasze rozumiynie zmian metabolicznych ôkryślōnych zortōw kōmōrek sprawiōnych ôgōlnym brakym produkcyje trifosforanu adenozyn (ATP) w mitochōndrialnym mōzgu je fundamyntalne (8), podkryślajōnc potrzeba idyntyfikacyje cylōw terapeutycznych, kere mogōm być używane do zapobiyganio abo zapobiyganio chorobōm. Zapobiyganie neurodegyneracyji (9). Brak informacyje polygo na tym, iże kōmōrki nerwowe sōm powszechnie uwożane za majōnce barzo ôgraniczōno elastyczność metaboliczno w porōwnaniu z zortami kōmōrek ôbtoczajōncych je tkanek (10). Bierōnc pod uwoga, iże te kōmōrki ôdgrywajōm głōwno rola we koordynowaniu lifrowanio metabolitōw do neurōnōw, coby prōmować transmisyjo synaptyczno i ​​ryagować na warōnki urazu i choroby, zdolność do przifasowanio metabolizmu kōmōrek do wymagajōncych warōnkōw tkanki mōzgowyj je bezma ôgraniczōno do kōmōrek glialnych (11-14). Ôkrōm tego niyôdłōnczno heterogyniczność kōmōrkowo tkanki mōzgowyj w srogij miarze zawodzo badaniu zmian metabolicznych, kere zachodzōm w ôkryślōnych podgrupach neurōnōw. W rezultacie niywiele wiadōmo ô akuratnych kōnsekwyncyjach kōmōrkowych i metabolicznych dysfunkcyje mitochōndrialnyj we neurōnach.
Coby zrozumieć kōnsekwyncyje metaboliczne dysfunkcyje mitochōndrialnyj, wyizolowali my neurōny Purkinje'a (PN) w roztōmajtych etapach neurodegyneracyje sprawiōnyj zniszczyniym fuzyje zewnyntrznyj błōny mitochōndrialnyj (Mfn2). Chocioż mutacyje Mfn2 u ludzi sōm zwiōnzane z formōm erbownyj motorycznyj neuropatyje sensorycznyj znanyj jako Charcot-Marie-Tootha zorta 2A (15), warōnkowe zniszczynie Mfn2 u mysi je dobrze rozpoznawanōm indukcyjōm dysfunkcyje fosforylacyje utlyniynio (OXthoPHOS). Roztōmajtym podtypōm neurōnōw (16-19) i wynikowymu fynotypowi neurodegyneracyjnym towarziszōm progresywne ôbjawy neurologiczne, take jak zaburzynia ruchu (18, 19) abo ataksyjo mōzgowo (16). Bez użycie kōmbinacyje proteōmiki bez ôznakowanio (LFQ), metabolomiki, ôbrazowanio i metod wirusologicznych, pokozujymy, iże progresywno neurodegyneracyjo mocno indukuje karboksylaza pirogrōniano (PCx) i inksze faktory bierōnce udział we arteriosklerozie PN in vivo Ekspresyjo ynzymōw. Coby zweryfikować znaczynie tego ôdkrycio, specyficznie ôbniżyli my ekspresyjo PCx w PN z niydostatkiym Mfn2 i stwiyrdziyli, iże ta ôperacyjo pogarszała stres oksydacyjny i przispiyszała neurodegyneracyjo, dowodzōnc tōż, iże azoospermijo dowa śmierć kōmōrkowo metaboliczno adaptacyjno zdolność. Ciynżko ekspresyjo MFN2 może do kōńca uratować degyneracyjo kōńcowo PN z ciynżkim niydobōrym OXPHOS, masywnym spotrzebowaniym mitochōndrialnego DNA i pozornie złōmanym necym mitochōndrialnym, co podkryślo dalij, iże ta forma neurodegyneracyje może nawet ôdburzyć sie we zaawansowanyj etapie choroby kōmōrkowyj.
Do wizualizacyje mitochōndriōw w nokautu PN Mfn2, użyliśmy mysiego szczypu, co przizwolo mitochōndriōm znoleżnym ôd Cre na cylowanie ekspresyje żōłtego fluorescyncyjnego biōłtka (YFP) (mtYFP) (20) Cre i wybadaliśmy morfologijo mitochōndrialno in vivo. Wykozali my, iże zniszczynie gynu Mfn2 w PN dokludzi do stopniowego tajlōngu necu mitochōndrialnego (Figura S1A), a nojwczasniejszo pōmiana ôstała znojdziōno we wieku 3 tydni. W przeciwiyństwie do tego, znaczōnco degyneracyjo warstwy kōmōrkowyj PN, jak dowodzi utrata immunofarbiynio kalbindyna, zaczła sie dopiyro we wieku 12 tydni (Figura 1, A i B). Niyzgodliwość czasu miyndzy nojwczasniyjszymi zmianami w morfologiji mitochōndrialnyj a widzialnym zaczōntkym śmierci neurōnōw skłōniyła nos do badanio zmian metabolicznych wywołanych bez dysfunkcyjo mitochōndrialno przed śmierciōm kōmōrkowōm. Ôbrobiyli my strategijo ôparto na zortowaniu kōmōrek aktywowanych bez fluorescyncyjo (FACS) do izolowanio PN eksprymujōncego YFP (YFP+) (Figura 1C), jak tyż u myszōw kōntrolnych (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), dalij ôkryślanyj za CT1BRL (Figura 1C). Ôptymalizacyjo strategije bramowanio ôparto na zglyndnyj intynsywności sygnału YFP przizwolo nōm na czyszczynie ciała YFP+ (YFPhigh) PN ôd niy-PN (YFPneg) (Figura S1B) abo dōmniymanych fluorescyncyjnych fragmyntōw aksōnōw/dendrytycznych (YFPlow; Figura S1D potwierdzōno bez Figura S1D, lewo). Coby zweryfikować tożsamość sklasyfikowanyj populacyje, przekludziyliśmy proteōmika LFQ, a potym analiza głōwnych skłodnikōw i wykozaliśmy, iże istnieje klarowne rozdzielynie miyndzy kōmōrkami YFPhigh i YFPneg (Figura S1C). Kōmōrki YFPhigh wykozały zbogacynie netto znanych markerōw PNs (tj. Calb1, Pcp2, Grid2 i Itpr3) (21, 22), ale brak zbogacynio biōłtek wszeôbecnie eksprymōwanych w neurōnach abo inkszych zortach kōmōrek (Figura 1D) ). Porōwnanie miyndzy prōbkami w sklasyfikowanych kōmōrkach YFPhigh zebranych w niyznoleżnych eksperymyntach wykozało spōłczynnik korelacyje> 0,9, co pokozuje na dobro reprodukowalność miyndzy replikami biologicznymi (Figura S1E). Podsumowujōnc, te dane potwierdziyły nasz plan akutnyj i specyficznyj izolacyje wykōnalnego PN. Pōniywoż użyty systym sterownik L7-cre indukuje rekōmbinacyjo mozaiki w piyrszym tydniu po porodzie (23), zaczliśmy ôdbiyrać mysze z CTRL i warōnkowych (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Zbiyrać neurōny. Po zakōńczyniu rekōmbinacyje je ôn nazywany Mfn2cKO we wieku 4 tydni. Za kōńcowy pōnkt ôbrali my 8 tydni wieku, kedy warstwa PN była niyruszōno mimo ôczywistyj fragmyntacyje mitochōndrialnyj (Figura 1B i Figura S1A). Ôgōlnie ôkryślyli my cołkość 3013 biōłtek, z kerych kole 22% było ôpartych na adnotacyjach MitoCarta 2.0 ôpartych na proteōmie mitochōndrialnym jako mitochōndria (Figura 1E) (Figura 1E) (24). Rōżnicowo analiza ekspresyje gynōw przekludzōno w tydniu 8 pokozała, iże ino 10,5% wszyskich biōłtek miało znaczōnce zmiany (Figura 1F i Figura S1F), z kerych 195 biōłtek było regulowanych w dōł, a 120 biōłtek było regulowanych w gōra (Figura 1F). Warto zauważyć, iże “innowacyjno analiza sztrek” tego zbioru danych pokozuje, iże rōżnicowo eksprymōwane gyny noleżōm głōwnie do ôgraniczōnego zbioru ôkryślōnych sztrek metabolicznych (Figura 1G). Co ciekawe, chocioż downregulacyjo sztrek zwiōnzanych z sygnalizacyjōm OXPHOS i wapnia potwierdzo indukcyjo dysfunkcyje mitochōndrialnyj w PN z niydostatkiym fuzyje, inksze kategoryje, kere ôbyjmujōm głōwnie metabolizm aminokwasōw, sōm znaczōnco wzglyndym regulowane, co je zgodliwe z metabolizmym, kery wystympuje we mitochōndrialnym P. dysfunkcyjo.
(A) Reprezentatywne kōnfokalne fotografije sekcyjōw mōzgu myszōw CTRL i Mfn2cKO pokozujōnce progresywno utrata PN (kalbindyna, szaro); jōndra były przeciwfarbiōne DAPI. (B) Kwantyfikacyjo (A) (jednospōłczynno analiza wariancyje, ***P<0,001; n = 4 do 6 ôkryngōw ôd trzech myszōw). (C) Eksperymyntalny przepływ roboty. (D) Dystrybucyjo karty ciepła markerōw specyficznych do Purkinje (wiyrch) i inkszych zortōw kōmōrek (po postrzodku). (E) Diagram Venna pokozujōncy wielość biōłtek mitochōndrialnych zidyntyfikowanych w sklasyfikowanym PN. (F) Grafik wulkanōw rōżnicowo eksprymōwanych biōłtek w neurōnach Mfn2cKO po 8 tydniach (wert ôdciyńcio znaczōństości 1,3). (G) Analiza sztrek kreatywności pokozuje piyńć nojwożniyjszych sztrek up-regulacyje (czerwōny) i down-regulacyje (modro) w Mfn2cKO PN sklasyfikowanych za 8 tydni. Pokazano strzedni poziōm ekspresyje kożdego wykrytego biōłtka. Karta ciepła we skali szarości: sprowniōny wert P. ns, niy ważne.
Dane proteōmiki pokozały, iże ekspresyjo biōłtek kōmpleksōw I, III i IV stopniowo spodkowo. Kōmpleksy I, III i IV wszyske zawiyrały podstawowe podjednostki zakodowane bez mtDNA, w czasie kej kōmpleks II, kery bōł ino zakodowany jōndrowo, bōł w głōwnym zorcie niywpłyniynty (Figura 2A i Figura S2A). . Zgodnie z wynikami proteōmiki, immunohistochymijo sekcyjōw tkanek mōzgu pokozała, iże poziōm podjednostki MTCO1 (mitochōndrialnyj podjednostki oksydazy cytochrōmu C 1) kōmpleksu IV w PN stopniowo spodkowoł (Figura 2B). Zakodowano bez mtDNA podjednostka Mtatp8 była znaczōnco zmyńszōno (Figura S2A), w czasie kej poziōm stacjōnarnego stanu podjednostki syntazy ATP zakodowanyj bez jōndro ôstoł niyzmiynny, co je zgodliwe ze znanym sztabilnym kōmpleksym F1 podzbioru syntazy ATP, kej ekspresyjo mtDNA je sztabilno. Formacyjo je spōjno. Przerwać (7). Ôcyna poziōmu mtDNA w zortowanych PN Mfn2cKO bez ryakcyjo lyńcuchowo polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) potwierdziyła stopniowy spadek liczby kopiji mtDNA. W porōwnaniu z grupōm kōntrolnōm, we wieku 8 tydni utrzimano było ino kole 20% poziōmu mtDNA (Figura 2C). Zgodnie z tymi wynikami, farbiynie kōnfokalnyj mikroskopije PN Mfn2cKO było użyte do wykrywanio DNA, co pokozało znoleżne ôd czasu spotrzebowanie nukleotydōw mitochōndrialnych (Figura 2D). Wykozali my, iże ino niykere kandydaty zaangażyrowane w degradacyjo biōłtek mitochōndrialnych i ryakcyjo na stres były regulowane w gōra, w tym Lonp1, Afg3l2 i Clpx jak tyż faktory słożōnego łōnczynio OXPHOS. Niy wykryto żodnych znaczōncych zmian w poziōmie biōłtek bierōncych udział w apoptozie (Figura S2B). Podanie, wykozali my, iże mitochōndria i kanały necu yndoplazmatycznego bierōnce udział we transportie wapnia majōm ino niywielge zmiany (Figura S2C). Ôkrōm tego ôcyna biōłtek zwiōnzanych z autofagijōm niy wykozała żodnych znaczōncych zmian, co je zgodliwe z widzialnōm indukcyjōm autofagosōmōw ôbserwowanōm in vivo bez immunohistochymijo i mikroskopijo elektrōnowo (Figura S3). Jednak progresywnyj dysfunkcyji OXPHOS w PN towarziszōm ôczywiste ultrastrukturalne zmiany mitochōndrialne. Grōmady mitochōndrialne idzie zoboczyć w ciałach kōmōrkowych i drzewach dendrytycznych PN Mfn2cKO w wieku 5 i 8 tydni, a struktura wewnyntrznyj błōny przeszła głymboke zmiany (Figura S4, A i B). Zgodnie z tymi zmianami ultrastrukturalnymi i znaczōncym spodkym mtDNA, analiza ôstrzejszych plackōw mōzgowego mōzgowego ze estrym metylowym tetrametylrodaminowym (TMRM) pokozała, iże potyncjoł błōny mitochōndrialnyj w PN Mfn2cKO bōł znaczōnco zmyńszōny (Figura S4C).
(A) Analiza przebiegu czasu poziōmu ekspresyje kōmpleksu OXPHOS. Rozwożōmy ino biōłtka z P<0,05 po 8 tydniach (dwudyrekcyjno ANOVA). Kropkowano linijo: Brak regulacji w porōwnaniu z CTRL. (B) Po lewyj: Przikłod sekcyje mōzgu ôznakowanyj przeciwciałym anty-MTCO1 (skala, 20 μm). Ôbszar zajmowany bez ciała kōmōrkowe Purkinje je pokryty żōłtym. Po prawyj: Kwantyfikacyjo poziōmōw MTCO1 (jednospōłczynno analiza wariancyje; n = 7 do 20 kōmōrek analizowanych ôd trzech myszōw). (C) analiza qPCR liczby kopiji mtDNA w zortowanym PN (jednospōłczynno analiza wariancyje; n = 3 do 7 myszōw). (D) Po lewyj: Przikłod ôdcinka mōzgu ôznakowanego przeciwciałym anty-DNA (skala, 20 μm). Ôbszar zajmowany bez ciała kōmōrkowe Purkinje je pokryty żōłtym. Po prawyj: Kwantyfikacyjo zmian mtDNA (jednospōłczynno analiza wariancyje; n = 5 do 9 kōmōrek ôd trzech myszōw). (E) Przikłod ôstrego przekroju mōzgu pokozujōncego kōmōrki mitoYFP + Purkinje'a (strzałka) w nagraniu cołkokōmōrkowego zaciśniyńcio plastra. (F) Kwantyfikacyjo krzywyj IV. (G) Reprezentatywne nagrania injekcyje depolaryzujōncego prōmiyni w kōmōrkach Purkinje'a CTRL i Mfn2cKO. Top trace: Piyrszy impuls, kery wywołoł AP. Spodnio ślada: Maksymalno frekwyncyjo AP. (H) Kwantyfikacyjo postsynaptycznych spōntanicznych wejść (sPSP). Reprezyntatywny szlak nagrowanio i jego stosunek zoomu sōm pokozane na (I). Jednospōłczynno analiza wariancyje analizowała n = 5 do 20 kōmōrek ôd trzech myszōw. Dane sōm wyrzekane jako strzednie±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Reprezentatywne szlaki spōntanicznego AP zaregistrowane ze użyciym trybu perforowanego ôbciōngu plastra. Top trace: Maksymalno frekwyncyjo AP. Spodni ślad: zoom jednego AP. (K) Kwantyfikuj strzednio i maksymalno frekwyncyjo AP podle (J). Test Manna-Whitneya; n = 5 kōmōrek było przeanalizowanych ôd sztyrech myszōw. Dane sōm wyrzekane jako strzednie±SEM; niy ważne.
Ôczywiste szkody OXPHOS były wykryte w 8-tygodniowym PN Mfn2cKO, co wskozuje na to, iże fizjologiczno funkcyjo neurōnōw je powożnie niyôbyczajno. Bez to przeanalizowali my pasywne cychy elektryczne neurōnōw z niydostatkiym OXPHOS po 4 do 5 tydniach i 7 do 8 tydniach bez przekludzanie nagrań cołkich kōmōrkowych zaciśniyńcio plastrōw w ôstrzejszych plackach mōzgu (Figura 2E). Niyôczekiwanie strzedni potyncjoł błōny spoczynkowyj i ôdporność wejściowo neurōnōw Mfn2cKO były podobne do kōntrole, chocioż były subtelne rōżnice miyndzy kōmōrkami (Tabula 1). Podanie, we wieku ôd 4 do 5 tydni niy stwiyrdzōno żodnych znaczōncych zmian w zwiōnzku prōmieniowo-napiyńcio (krzywo IV) (Figura 2F). Jednak żodyn neurōn Mfn2cKO we wieku ôd 7 do 8 tydni niy przetrwoł reżimu IV (krok hiperpolaryzacyje), co wskozuje na to, iże na tym pōźnym etapie istnieje klarowno wrażliwość na potyncjoł hiperpolaryzacyje. W przeciwiyństwie do tego, w neurōnach Mfn2cKO strumyny depolaryzujōnce, kere powodujōm powtarzalne wyładowania potyncjołu czynnościowego (AP), sōm dobrze tolerowane, co wskozuje na to, iże jejich ôgōlne mustry wyładowanio niy rōżniōm sie znaczōnco ôd tych w 8-tygodniowych neurōnach kōntrolnych (tabula 1 i figura 2G). Podanie, czynstość i ampituda spōntanicznych sztrōmōw postsynaptycznych (sPSC) były porōwnowalne do tych w grupie kōntrolnyj, a czynstość zdarzyń wzrosła z 4 tydni do 5 tydni do 7 tydni do 8 tydni z podobnym wzrōstym (Figura 2, H i I). Ôkres dojzdrzynio synaptycznego w PN (25). Podobne wyniki ôstały uzyskane po perforowanych plastrach PNs. Ta kōnfiguracyjo zapobiygo możliwyj kōmpōnsacyji kōmōrkowych defektōw ATP, jak może sie stać w nagrowaniu cołkich kōmōrkowych ôbciōngōw plastrowych. Nojbarzij niy miały wpływu na potyncjoł błōny spoczynkowyj i frekwyncyjo spōntanicznego strzelanio neurōnōw Mfn2cKO (Figura 2, J i K). Podsumowujōnc, te wyniki wskazujōm, iże PN z ôczywistōm dysfunkcyjōm OXPHOS mogōm dobrze sprostać wysokofrekwyncyjnym mustram rozładowanio, co wskazuje na to, iże istnieje mechanizm kōmpynsacyjny, kery przizwolo im utrzimać hned normalne ryakcyje elektrofizjologiczne.
Dane sōm wyrzekane jako strzednie ± SEM (jednospōłczynno analiza wariancyje, test wielokrotnego porōwnowanio Holma-Sidaka; *P<0,05). Numer jednostki je ôkryślōny bez nawiasia.
Postanowiyli my zbadać, eli jakoś kategoryjo we zbiorze danych proteōmiki (Figura 1G) ôbyjmuje sztreki, kere mogōm przeciwstawić sie ciynżkimu niydostatkowi OXPHOS, klarujōnc w tyn spōsōb, czymu tykniynty PN może utrzimać hned normalno elektrofizjologijo (Figura 2, ôd E do K). . Analiza proteōmiczno wykozała, iże ynzymy bierōnce udział w katabolizmie aminokwasōw z rozgałynziōnym lyńcuchym (BCAA) były znaczōnco wzglyndym regulowany (Figura 3A i Figura S5A), a ôstateczny produkt acetyl-CoA (CoA) abo sukcynyl CoA mogōm uzupełniać trikarboksylany w akteryjosklerozie TCA). Wykozali my, iże zawartość transaminazy BCAA 1 (BCAT1) i BCAT2 wzrosła. Katalizujōm piyrszy etap katabolizmu BCAA bez gynerowanie glutaminianu z α-ketoglutaranianu (26). wszyske podjednostki, kere tworzōm kōmpleks rozgałynziōnego lyńcucha ketokwasowyj dehydrogenazy (BCKD), sōm regulowane na wiyrch (kōmpleks katalizuje niyskorniyjszo i niyôdwracalno dekarkboksylacyjo wynikowego szkeletu wōnglowego BCAA) (Figura 3A i Figura S5A). Jednak w zortowanym PN niy stwiyrdzōno żodnych ôczywistych zmian w samym BCAA, co może być sprawiōne zwiynkszōnym pochłōniym kōmōrkowym tych niezbyndnych aminokwasōw abo użyciym inkszych zdrzōdeł (glukozy abo kwasu mlekowego) do uzupełniynio cyklu TCA (Figura S5B). PN bez OXPHOS wykozały tyż zwiynkszōno aktywność rozkłodu i transaminacyje glutaminy we wieku 8 tydni, co może być ôdzwierciedlowane na wzglyndnyj regulacyji mitochōndrialnych ynzymōw glutaminazy (GLS) i transaminazy pirogrōnianu glutaminy 2 (GPT2) (Figura 3, A i C). Warto zauważyć, iże up-regulacyjo GLS je ôgraniczōno do łōnczōnyj izoformy glutaminazy C (GLS-GAC) (zmiana Mfn2cKO/CTRL je kole 4,5-krotno, P = 0,05), a jeji specyficzno up-regulacyjo w tkankach nowotworowych może spiyrać mitochōndrialno. (27).
(A) Karta ciepła pokozuje zmiana poziōmu biōłtka bez ôkryślōno trasa po 8 tydniach. (B) Przikłod ôdcinka mōzgu ôznakowanego przeciwciałym anty-PCx (skala, 20 μm). Żōłto strzałka skazuje na ciało kōmōrki Purkinje'a. (C) Analiza ekspresyje biōłtka w czasie zidyntyfikowano za wożny kandydat do aterosklerozy (wielokrotny test t, *FDR <5%; n = 3-5 myszōw). (D) Powyżyj: Schematyczny diagram pokozujōncy roztōmajte spōsoby wkludzanio ôznakowanego wōngla zawartego w [1-13C] tracerze piruwianu (to znaczy bez PDH abo drōga transarterialno). Dodku: Skrzypkowo wykres pokozuje procynt jednoznakowanego wōngla (M1) przekształcōnego w kwas aspartowy, kwas citrōnowy i kwas jabłowy po ôznakowaniu ôstrzejszych plackōw mōzgu [1-13C]pirownianym (paired t-test; ** P <0,01). (E) Wszechstrōnno analiza historyje czasu wskazanyj ścieżki. Rozwożōmy ino biōłtka z P<0,05 po 8 tydniach. Kreskowano linijo: brak wertu regulacji (dwudyrekcyjno analiza wariancyje; * P <0,05; *** P <0,001). Dane sōm wyrzekane jako strzednie±SEM.
W naszōm analizie katabolizm BCAA stoł sie jednōm z kluczowych sztrek up-regulacyje. Tyn fakt moc sugeruje, iże ôbjyntość wyntylacyje, kero wchodzi do cyklu TCA, może być zmiyniōno w PN bez OXPHOS. Może to stanowić głōwno forma przekablowanio metabolicznego neurōnōw, kere może mieć bezpostrzedni wpływ na fizjologijo neurōnōw i przeżywalność w czasie utrzimanio ciynżkij dysfunkcyje OXPHOS. Zgodnie z tōm hipotezōm, wykozali my, iże głōwny ynzym przeciwaterosklerotyczny PCx je regulowany w gōra (Mfn2cKO/CTRL zmiynio sie kole 1,5 razy; figura 3A), co katalizuje kōnwersyjo pirogrōnianu na reksalaocetan (28), kery uwożo sie, iże je w tkankach a2. 30). Zgodnie z wynikami proteōmiki, mikroskopijo kōnfokalno wykozała, iże ekspresyjo PCx była specyficznie i znaczōnco zwiynkszōno u PN z niydostatkiym OXPHOS, w czasie kej reaktywność PCx była głownie ôgraniczōno do sōmsiednich kōmōrek glialnych Bergmanna kōntrole (Figura 3B). Coby funkcjōnalnie przebadać zaôbserwowano upregulacyjo PCx, lyczyli my ôstre plasterki mōzgu ze pōmocōm [1-13C]pyruwianowego tracer. Kej pirogrōnian bōł utlyniōny bez pirogrōnianowo dehydrogenaza (PDH), jego etyketa izotopowo znikła, ale je włōnczōny do postrzednich produktōw cyklu TCA, kej pirogrōnian je metabolizowany bez reakcyje naczyniowe (Figura 3D). Na sparcie naszych danych proteōmicznych zaôbserwowali my srogo liczba markerōw z tego tracera w kwasie aspartanowym plackōw Mfn2cKO, w czasie kej kwas citrōnowy i kwas jabłowy tyż miały strzedni trynd, choć niy znaczōncy (Figura 3D).
W neurōnach dōpaminowych myszōw MitoPark z dysfunkcyjōm mitochōndrialnōm sprawiōnōm bez neurōny dōpaminowe, kere specyficznie niszczōm gyn mitochōndrialnego faktora transkrypcyje A (Tfam) (Figura S6B), ekspresyjo PCx była tyż znaczōnco regulowano w gōra (31), co wskozuje na to, iże neurofunkcyjno dysfunkcyjo arteriosklerozy kwasu acetōnowego je OKSFOS w ôrganizmie. Warto zauważyć, iże wykozano, iże unikatowe ynzymy (32-34), kere mogōm być eksprymowane we neurōnach, kere mogōm być zwiōnzane z arteriosklerozōm, sōm znaczōnco wzglyndym regulowany w PN brakujōncych OXPHOS, takich jak karboksylaza propiōnilo-CoA (PCC-A), kōnwertyje propiōnyl-CoA i sukcelykodry-CoA w ynzym 3 (ME3), kerego głōwnōm rolōm je ôdzyskanie pirogrōnianu z minnianu (Figura 3, A i C) (33, 35). Ôkrōm tego, ôdkryliśmy znaczōncy wzrōst ynzymu Pdk3, kery fosforyluje i tōż inaktywuje PDH (36), w czasie kej niy wykryto żodnych zmian w ynzymie Pdp1, kery aktywuje PDH abo w samym kōmpleksie ynzymowym PDH (Figura 3A). Spōjnie, w PN Mern2cKO fosforylacyjo podjednostki α1 α (PDHE1α) skłodnika pirogrōnianowyj dehydrogenazy E1 kōmpleksu PDH w Ser293 (znany z tego, iże hamowo aktywność ynzymowo PDH) była zwiynkszōno ( Figura S6C) (Figura S6C). Pirogrōnian niy mo dostympu naczyniowego.
Yntlich, wykozali my, iże super sztreka biosyntezy seryny i glicyny, pokrewny cykl mitochōndrialny folianu (1C) i biosynteza proliny (Figura 1G i Figura S5C) sōm wszyske znaczōnco wzglyndym regulowane, podle doniesiyń, w czasie procesu aktywacyje. Ôbtoczajōnce tkanki sōm aktywowane przi dysfunkcyji mitochōndrialnyj (5-7). Analiza kōnfokalno potwierdzajōnco te dane proteōmiki pokozała, iże w PN z brakym OXPHOS, plasterki mōzgu 8-tygodniowych myszōw poddano było serynowyj hydroksymetyltransferazie 2 (SHMT2), kluczowymu ynzymowi mitochōndrialnego cyklu folianowego. Znaczōnco immunologiczno ôdpowiydź (Figura S5D). W 13 inkubowanych z CU-glukozōm ôstrzejszych plackōw mōzgowych eksperymynta z śledzyniym metabolicznym potwierdziyły dalij wzrōst regulacyje biosyntezy seryny i proliny, co wskazuje na to, iże przepływ izoform wōnglo do seryny i proliny wzrōs (Figura S5E). Pōniywoż reakcyje prōmowane bez GLS i GPT2 sōm ôdpowiedzialne za synteza glutaminianu z glutaminy i transaminacyjo miyndzy glutaminianym a α-ketoglutaranianym, jejich upregulacyjo wskozuje, iże neurōny z niydostatkiym OXPHOS majōm zwiynkszōny zapotrzebowanie na glutaminian . Może to być skerowane na utrzimanie zwiynkszōnyj biosyntezy proureliny (Fig5). W przeciwiyństwie do tych zmian, proteōmiczno analiza astrocytōw mōzgowych ôd PN-specyficznych myszōw Mfn2cKO pokozała, iże te sztreki (w tym wszyske antyperoksydazy) niy zmiyniały sie znaczōnco w ekspresyji, co pokozuje, iże Ta przekerowanie metaboliczne je selektywne do zdegradowanego PN do D (fig. S6, G).
Podsumowujōnc, te analizy wykozały znaczōnco roztōmajte mustry czasowyj aktywacyje ôkryślōnych sztrek metabolicznych w PN. Chocioż niyôbyczajno funkcyjo mitochōndrialno neurōnōw może kludzić do wczasnyj aterosklerozy i remodelowanio 1C (Figura 3E i Figura S5C), a nawet do przewidowalnych zmian w ekspresyji kōmpleksōw I i IV, zmiany w syntezie seryny de novo sōm ino ôczywiste ino w pōźnym etapie. Dysfunkcyjo OXPHOS (Figura 3E i Figura S5C). Te ôdkrycia definiujōm sekwyncyjny proces, w kerym indukowany bez stres mitochōndrialny (cykl 1C) i cytōmplazmatyczny (biosynteza seryny) ôdpowiadajōm synergicznie ze wzrōstym aterosklerozy w cyklu TCA, coby pōmiynić metabolizm neurōnōw.
8-tygodniowe PN z niydostatkiym OXPHOS mogōm utrzimać wysokofrekwyncyjno aktywność wzbudzanio i przejść znaczōnce rekōnekcyjo metaboliczne, coby rykōmpynsować dysfunkcyjo mitochōndrialno. To ôdkrycie powoduje interesantno możliwość, iże nawet w tym mōmyncie te kōmōrki mogōm tyż dostać interwyncyjo terapeutyczno, coby ôpōźnić abo zapobiygać neurodegyneracyji. Niyskoro. Rozwiōnzali my ta możliwość bez dwie niyznoleżne interwyncyje. W piyrszyj metodzie zaprojektowali my wektōr wirusa zwiōnzanego z adenōm (AAV) znoleżny ôd Cre, tak coby MFN2 mōg być selektywnie eksprymōwany w PN z niydostatkiym OXPHOS in vivo (Figura S7A). AAV kodujōncy MFN2 i fluorescyncyjny gyn reporter mCherry (Mfn2-AAV) były zweryfikowane w kulturach piyrwotnych neurōnōw in vitro, co sprawiyło ekspresyjo MFN2 w spōsōb znoleżny ôd Cre i uratowało morfologijo mitochōndrialno, zapobiygajōnc tym samym neurōmutacyjōm w Mfn2KO i B Figura S7). Dalij przekludziyli my eksperymynta in vivo, coby stereotaktycznie dostarczyć 8-tygodniowego Mfn2-AAV do skōry mōzgowyj myszōw Mfn2cKO i kōntrolnych, jak tyż przeanalizowali 12-tygodniowe mysze (Figura 4A). Lyczōne mysze Mfn2cKO umarły (Figura 1, A i B) (16). Transdukcyjo wirusowo in vivo powodowała selektywno ekspresyjo PN w niykerych kryngach mōzgowych (Figura S7, G i H). Injekcyjo kōntrolnego AAV eksprymujōncego ino mCherry (Ctrl-AAV) niy miała żodnego znaczōncego wpływu na stopiyń neurodegyneracyje u zwiyrzōnt Mfn2cKO. W przeciwiyństwie do tego, analiza Mfn2cKO transdukowanych Mfn2-AAV wykozała znaczōncy ôchrōnny efekt warstwy kōmōrkowyj PN (Figura 4, B i C). Nojbarzij tyngość neurōnōw zdowo sie być bezma niyôdrōżnialno ôd zwiyrzōw kōntrolnych (Figura 4, B i C jak tyż Figura S7, H i I). Ekspresyjo MFN1, ale niy MFN2, je tak samo skuteczno w ratowaniu śmierci neurōnōw (Figura 4C i Figura S7, C i F), co wskazuje, iże ekspresyjo ektopicznego MFN1 może skutecznie uzupełnić brak MFN2. Dalszo analiza na poziōmie pojedynczego PN pokozała, iże Mfn2-AAV w srogij miarze uratowoł ultrastruktura mitochōndriōw, normalizowoł poziōm mtDNA i ôdwrōciōł wysoko ekspresyjo markera antyangiogynezy PCx (Figura 4, C do E ). Wizualno kōntrola uratowanych myszōw Mfn2cKO we stanie ôdpoczynku pokozała, iże jejich postawa i ôbjawy motoryczne (ruch S1 do S3) były poprawiōne. Podsumowujōnc, te eksperymynta pokozujōm, iże ôdwłōczōno reintrodukcyjo MFN2 do PN z powożnie niydostatkiym OXPHOS je stykajōnco do ôdwrōcynio kōnsumpcyje mtDNA i wywoływanio aterosklerozy, zapobiygajōnc w tyn spōsōb degyneracyji aksōnōw i śmierci neurōnōw in vivo.
(A) Schema pokozujōncy eksperymyntalny harmōnogram wstrzikniyńcio AAV kodujōncego MFN2, kej wskazano sztreka metaboliczno je aktywowano. (B) Reprezentatywne ôbrazy kōnfokalne 12-tygodniowych plackōw mōzgu transdukowanych po 8 tydniach u myszōw Mfn2cKO i ôznakowanych przeciwciałym anty-Calbindin. Po prawyj: Skalowanie włōkyn aksōnowych. Skala zoomu aksōnōw wynosi 450 i 75 μm. (C) Po lewyj: Kwantyfikacyjo tyngości kōmōrek Purkinje'a w pyntle transdukcyje AAV (AAV+) (jednospōłczynno analiza wariancyje; n = 3 mysze). Po prawyj: analiza fokusu mtDNA w transdukowanym PN w tydniu 12 (niysparowany test t; n = 6 kōmōrek ôd trzech myszōw). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentatywne transmisyjne mikrografy elektrōnowe PN sekcyji mōzgowych Mfn2cKO transdukowanych ze wskazanymi wektorami wirusowymi. Rōżowo maska ​​ilustruje ôbszar zajmowany bez dendryty, a żōłty kropkowany kwadrat ilustruje zoom zapewniōny po prawyj zajcie; n reprezyntuje jōndro. Szkala skali, 1μm. (E) pokozuje przikłod farbiynio PCx w PN transdukowanym po 12 tydniach. Pōłka skale, 20μm. OE, nadekspresyjo; FC, zmiana fałdōw.
Yntlich zbadali my znaczynie przeżywalności kōmōrek indukowanyj bez peroksydaza w PN, kere doświadczyły dysfunkcyje OXPHOS. Wygynerowały my mCherry kodujōnce AAV-shRNA (krōtke RNA ze szpicy wosōw) kōnkretnie cylujōnce w mysi mRNA PCx (AAV-shPCx) i wstrzikniyli wirus abo jego skramblowano kōntrola (AAV-scr) do mōzgu mysi Mfn2cKO. Injekcyjo przekludzōno we sztwortym tydniu wieku (Figura 5A), coby ôsiōngnōńć efektywny nokaut PCx w ôkresie, kej ekspresyjo PCx wzrosła (Figura 3C), a warstwa kōmōrkowo PN była durch niyruszōno (Figura 1A). Warto zauważyć, iże zbicie PCx (Figura S8A) prowadzi do znaczōncego prziśpiyszynio śmierci PN, kere je ôgraniczōne do zainfekowanego piestrzynia (Figura 5, B i C). Coby zrozumieć mechanizm efektōw metabolicznych indukowanych bez up-regulacyjo PCx, podszukowali my status redoks PN po nokaucie PCx i ôptyczny bioczujnik Grx1-roGFP2 pośredniczōny bez AAV bōł w tym samym czasie eksprymōwany (Figura S8, B do D) do ôcyny glutationynu peptydu zglyndnego8. Potym przekludziyliśmy dwufotōnowo fluorescyncyjno mikroskopijo ôbrazowanio czasu życio (FLIM) w ôstrzich plasterkach mōzgu 7-tygodniowych Mfn2cKO abo kōntrolnych miotōw, coby wykryć potyncjalne zmiany we cytōmplazmatycznym stanie redoks po weryfikowaniu warōnkōw FLIM (Figura S8, E do G). Analiza wykozała znaczōncy wzrōst stanu utlyniynio pojedynczych PN Mfn2cKO bez ekspresyje PCx, co je inksze ôd neurōnōw kōntrolnych abo PN Mfn2cKO eksprymujōncych ino skramblowane shRNA (Figura 5, D i E). Kedy ekspresyjo PCx była down-regulowano, procynt PN Mfn2cKO wykazujōncych stōn wysoko utlyniōny wzrōs ô wiyncyj jak trzi razy (Figura 5E), co wskozuje na to, iże up-regulacyjo PCx utrzimowała zdolność redoks zdegynerowanych neurōnōw.
(A) Schema pokozujōncy eksperymyntalny harmōnogram wstrzikniyńcio AAV kodujōncego shPCx, kej wskazano sztreka metaboliczno je aktywowano. (B) Reprezentatywne kōnfokalne fotografije 8-tygodniowych przekrojōw mōzgu u myszōw Mfn2cKO transdukowanych i ôznakowanych przeciwciałym antykalcyneuriny po 4 tydniach. Szkala, 450μm. (C) Kwantyfikacyjo tyngości kōmōrek Purkinje'a w pytlach transdukowanych bez AAV (jednospōłczynno analiza wariancyje; n = 3 do 4 myszōw). Dane sōm wyrzekane jako strzednie±SEM; ***P<0,001. (D) Reprezentatywny ôbroz FLIM pokozuje strzednio ôdwłoka życio 7-tygodniowego PN eksprymujōncego czujnik redoks glutationu Grx1-roGFP2 w ôkryślōnych warōnkach eksperymyntalnych. Stosunek LUT (tabuła wyglōndu): przedzioł czasu przeżywalności (w pikosekundach). Barka skale, 25μm. (E) Histogram pokozuje dystrybucyjo wartości życio Grx1-roGFP2 z (D) (n=158 do 368 kōmōrek u dwōch myszōw w kożdym warōnku). Kluczowy wykres nad kożdym histogramym: pokozuje liczba kōmōrek ô znacznie dugszych (czerwōnych, utlyniōnych) abo krōtszych (błynkitnych, zmyńszōnych) wartościach życio, kere przekroczajōm 1 SD strzednij wartości życio w CTRL-AAV-scr. (F) Propōnowany model pokozuje ôchrōnny efekt upregulacyje neurōnowego PCx.
Co wszysko, dane, kere dostarczōmy tukej, pokozujōm, iże reekspresyjo MFN2 może do kōńca uratować zaawansowany PN z ciynżkim niydostatkym OXPHOS, ciynżkim deplycyjōm mtDNA i ekstremalnie niyôbyczajnōm morfologijōm istapodobnōm, zapewniajōnc tym samym ciōngły postymp nawet w zaawansowanych chorobach. Neurodegyneracyjo dostarczo ôdwrocalnych dowodōw na etapa przed śmierciōm kōmōrki. Tyn stopiyń elastyczności metabolicznyj podkryślo zdolność neurōnōw do wywołowanio aterosklerozy (przekablowanie cyklu TCA), kere hamowo ekspresyjo PCx w PN pozbytych OXPHOS i zwiynkszo śmierć kōmōrek, ôdgrywajōnc w tyn spōsōb rola ôchrōnno (Figura 5F).
W tym badaniu dolifrowali my dowodōw na to, iże ôdpowiydź PN na dysfunkcyjo OXPHOS je stopniowo zbieżność do aterosklerozy cyklu TCA bez sztreka rōżnicowyj aktywacyje aktywowano bez programy metaboliczne. Potwierdziyli my analiza proteōmiczno za pōmocōm mocki kōmplymyntarnych metod i pokozali, iże kej sōm wyzwane bez ciynżko dysfunkcyjo mitochōndrialno, neurōny majōm wczasnij niyznōmo forma elastyczności metabolicznyj. Ku naszemu udziwiyniu cołki proces przekablowanio niykōniecznie ôznaczo kōńcowy stan metaboliczny, kery towarziszy neurodegyneracyji stopniowo i niyôdwracalnie, ale nasze dane sugerujōm, iże może ôn stanowić neurōn podtrzimujōncy nawet we etapie przed śmierciōm kōmōrki Mechanizm funkcjōnalny kōmpōnsacyje. To ôdkrycie wskazuje, co neurōny majōm srogi stopiyń plastyczności metabolicznyj w ôrganizmie. Tyn fakt dowodzi, iże niyskorniyjszo reintrodukcyjo MFN2 może ôdwrōcić ekspresyjo kluczowych markerōw metabolicznych i zapobiyc degyneracyji PN. Przeciwnie, hamowo ateroskleroza i przispiyszo nerwy. transseksualnych.
Jednym z nojbarzij fascynujōncych ôdkryć naszych badań je to, iże PN bez OXPHOS mogōm modyfikować metabolizm cyklu TCA bez ynzymy, kere specyficznie stymulujōm arterioskleroza. Przeukładanie metaboliczne je wspōlnōm cychōm kōmōrek nowotworowych, z kerych niykere polygajōm na glutaminie, coby uzupełnić postrzednie substancyje cyklu TCA, coby wytwarzać ôdpedniki redukcyjne, kere napyndzajōm lyńcuch dychacych i utrzimujōm produkcyjo prekursorōw biosyntezy lipidōw i nukleotydōw (39 , 40). Niydowne badania wykozały, iże w tkankach ôbwodowych, kere doświadczajōm dysfunkcyje OXPHOS, widzialnōm cychōm je tyż rekōnekcyjo metabolizmu glutaminy/glutaminianu (5, 41), kaj kerōnek wchodu glutaminy do cyklu TCA zależy ôd Skuli ciynżkości szwanku OXPHOS (41). ). Brakuje jednak klarownych dowodōw na podobiyństwo plastyczności metabolicznyj neurōnōw w ôrganizmie i jeji możliwe znaczynie w kōntekście choroby. W niydownym badaniu in vitro wykozano, iże piyrwotne neurōny kortykalne mobilizujōm bazy glutaminianu do neurotransmisyje, prōmujōnc tym samym metabolizm oksydacyjny i ateroskleroza w warōnkach stresu metabolicznego (42). Warto zauważyć, iże przi farmakologicznym hamowaniu ynzymu cyklu TCA sukcynianowyj dehydrogenazy, uwożo sie, iże karboksylacyjo pirogrōnianu utrzimuje synteza ôksaloocetanu w chowanych neurōnach ziorniczkōw mōzgu (34). Jednak fizjologiczne znaczynie tych mechanizmōw do tkanki mōzgowyj (kaj uwożo sie, iże ateroskleroza je głōwnie ôgraniczōno do astrocytōw) durch mo wożne znaczynie fizjologiczne (43). W tym przipadku nasze dane pokozujōm, iże PN uszkodzōne bez OXPHOS w ôrganizmie mogōm być przełōnczōne na degradacyjo BCAA i karboksylacyjo pirogrōnianu, kere sōm dwōma głōwnymi zdrzōdłami suplementacyje postrzednich substancyjōw basenu TCA. Chocioż dōmniymany wkłod katabolizmu BCAA w metabolizm ynergije neurōnōw bōł zapropōnowany, ôkrōm roli glutaminianu i GABA w neurotransmisyji (44), durch niy ma dowodōw na te mechanizmy in vivo. Bezto łacno spekulować, iże dysfunkcjōnalne PN mogōm autōmatycznie rykōmpynsować kōnsumpcyjo postrzednich produktōw TCA napyndzanych bez proces asymilacyje bez zwiynkszanie aterosklerozy. Nojbarzij upregulacyjo PCx może być wymogano do utrzimanio zwiynkszōnego zapotrzebowanio na kwas aspartowy, co je sugeruje w proliferujōncych kōmōrkach z dysfunkcyjōm mitochōndrialnōm (45). Jednak nasz analiza metabolomiczno niy wykozała żodnych znaczōncych zmian w poziōmie stacjōnarnego stanu kwasu aspartanowego w PN Mfn2cKO (Figura S6A), co nojpewnij ôdzwierciedlo roztōmajte metaboliczne wykorzystanie kwasu aspartanowego miyndzy proliferujōncymi kōmōrkami a postmitotycznymi neurōnami . Chocioż akuratny mechanizm upregulacyje PCx w dysfunkcjōnalnych neurōnach in vivo ôstowo do skarakteryzowanio, wykozali my, iże ta wczasno ôdpowiydź ôdegrowa wożno rola w utrzimaniu stanu redoks neurōnōw, co było wykozane w eksperymyntach FLIM na plasterkach mōzgu. Nojbarzij zapobiyganie PN-ōm w gōra regulowanio PCx może kludzić do barzij utlyniōnego stanu i przispiyszyć śmierć kōmōrek. Aktywacyjo degradacyje BCAA i karboksylacyjo pirogrōnianu niy sōm spōsobami karakteryzowanio tkanek ôbwodowych dysfunkcyje mitochōndrialnyj (7). Bezto wydajōm sie być priorytetowōm cychōm neurōnōw z niydostatkiym OXPHOS, nawet jeźli niy jedynōm cychōm, kero je wożno do neurodegyneracyje. .
Choroba mōzgu je heterogynicznōm zortōm choroby neurodegyneracyjnyj, kero zwykle przejawio sie jako ataksyjo i czynsto szkodzi PN (46). Ta populacyjo neurōnōw je ôsobliwie podatno na dysfunkcyjo mitochōndrialno, skuli tego, co jejich selektywno degyneracyjo u myszōw styko do reprodukowanio mocy ôbjawōw motorycznych, kere karakteryzujōm ludzko ataksyjo krōnżkowo-mōzgowo (16, 47, 48). Podle doniesiyń, transgyniczny mysi model ze zmutowanym gynym je zwiōnzany z ludzkōm ataksyjōm krōnżkowo-mōzgowo i mo dysfunkcyjo mitochōndrialno (49, 50), co podkryślo znaczynie podszukowanio kōnsekwyncyjōw niydostatku OXPHOS w PNPH. Bezto ôsobliwie ôdpowiednie je skuteczne izolacyjo i badanie tyj unikatownyj populacyje neurōnōw. Jednak, kej weźnie sie pod uwoga, iże PN sōm barzo wrażliwe na ciśniynie i stanowiōm niski udzioł cołkij populacyje kōmōrek mōzgowych, w przipadku mocy badań ôpartych na ômice selektywne rozdzielynie jejich jako cołkich kōmōrek je durch wyzwaniowym aspektym. Chocioż bezma niymożebne je ôsiōngniyńcie absolutnego braku skażynio inkszych zortōw kōmōrek (ôsobliwie majoryntnych tkanek), połōnczyli my skuteczny krok dyssociacyje z FACS, coby uzyskać stykajōnco wielość żywotnych neurōnōw do downstream analizy proteōmicznyj i majōm doś wysoke pokrycie biōłtkowe, kere porōwnowało danych cerexibel) (51). Bez zachowanie żywotności cołkich kōmōrek, metoda, kero zapewniōmy tukej, przizwolo nōm niy ino na wybadanie zmian we sztrekach metabolicznych w mitochōndriach, ale tyż na wybadanie zmian w jejich cytōmplazmatycznych ôdpowiednikach, co dopołnio użycie znacznikōw błōnnych mitochōndrialnych do zbogacanio zorty tkanek michondrycznych. (52, 53). Metoda, kero ôpisujymy, niy je ino zwiōnzano z badaniym kōmōrek Purkinje'a, ale może być łacno zastosowano do kożdyj zorty kōmōrki do ôdpowiedzi na zmiany metaboliczne w chorych mōzgach, w tym inkszych modelōw dysfunkcyje mitochōndrialnyj.
Yntlich zidyntyfikowali my ôkno terapeutyczne w czasie procesu przeukładanio metabolicznego, kere może doimyntnie ôdwrōcić kluczowe ôznaki stresu kōmōrkowego i zapobiygać degyneracyji neurōnōw. Bezto zrozumiynie funkcjōnalnych implikacyjōw ôpisanego tukej przekablowanio może dostarczyć fundamyntalnych wglōndōw na możliwe lyczynia utrzimanio żywotności neurōnōw w czasie dysfunkcyje mitochōndrialnyj. Przidajne badania cylowane na sekcyjo zmian w metabolizmie ynergije w inkszych zortach kōmōrek mōzgowych sōm przidajne, coby w połni ujawnić zastosowanie tego prawidła do inkszych chorōb neurōlogicznych.
Mysze MitoPark były ôpisane wczasnij (31). Mysze C57BL/6N z loxP flankujōncymi gynami Mfn2 były ôpisane wczasnij (18) i skrziżowane z myszami L7-Cre (23). Powstałe podwōjne heterozygotyczne potōmstwo było potym skrziżowane z hōmozygotycznymi myśami Mfn2loxP/Mfn2loxP, coby wygynerować nokauty gynōw specyficzne dlo Purkinje'a dlo Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). W podzbiorze godowanio allel SorStop-mito-YFP Gt (ROSA26) bōł wkludzōny bez ekstra krziżowanio (20). wszyske procedury na zwiyrzach były przekludzane zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjōnalnymi wytycznymi i zatwierdzōnymi ôd LandesamtfürNatur z Umwelt i Verbraucherschutz, Rajna Pōłnocno-Westfalijo, Niymce. Robota nad zwiyrzami podōnżo sie tyż za wytycznymi Europejskij Federacyje Stowarziszyń Laboratoryjnych Nauk ô Zwiyrzyntach.
Po zniyszkowaniu wychrōniynio szyiku matki ôd kobiyty w ciōnży, mysi ymbriōn je wyizolowany (E13). Skōra była sekcjōnowano w roztworze zrōwnoważōnyj solnyj Hanksa (HBSS) dopołniōnym 10 mM Hepes i przekozano na ôstrzodek Modified Eagle'a Dulbecco zawiyrajōncy papaina (20 U/ml) i cysteina (1μg/ml). Inkubować tkanka w DMEM) i dyssociować ja bez ynzymatyczne trowiynie. Ml) w tymperaturze 37°C bez 20 minut, a potym mechanicznie mlyne w DMEM dopołniōnym 10% płodowym serumym bydła. Kōmōrki były nasiywane na szklanych pokrywkach pokrytych polilizynōm przi tyngości 2×106 na 6 cm chowanio abo przi tyngości 0,5×105 kōmōrek/cm2 do analizy ôbrazowyj. Po 4 godzinach ôstrzodek zastōmpiōno ôstrzodkiym bez serum Neurobasal zawiyrajōncym 1% suplementu B27 i 0,5 mM GlutaMax. Neurōny były potym utrzimowane w tymperaturze 37°C i 5% CO2 bez cołki eksperymynt i karmiōne raz w tydniu. Coby wywołać rekōmbinacyjo in vitro, 3 μl (24-domkowy szkoł) abo 0,5 μl (24-domkowy platy) nastympujōncego wektora wirusa AAV9 było użyte do lyczynio neurōnōw w drugim dniu in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Adgyn, numer katalogu 105530-AAV9) i AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Adgyn, numer katalogu 105545-AAV9).
Mysie kōmplymyntarne DNA Mfn1 i Mfn2 (dostane z plazmidu Addgene #23212 i #23213, ôdpednio) je ôcychowane sekwyncyjōm V5 (GKPIPNPLLGLDST) na krańcu C i je łōnczōne z mCherry w rōmce bez sekwyncyjo T2A. Grx1-roGFP2 je darowiznōm ôd Hejdelberga TP Dicka DFKZ (Niymiecke Cyntrum Podszukowań). Bez zastōmpiynie kasety tdTomato ze użyciym kōnwyncjōnalnych metod klōnowanio, kaseta była subklōnowano do szkeletu pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numer ôdniesiynio przidatku 28306), coby wygynerować pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFGAV2-V5, Wektory FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 i pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Podobno strategijo była użyto do wygynerowanio wektora kōntrolnego pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Do wygynerowanio kōnstruktu AAV-shPCx przidajny je plazmidowy wektōr AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), co zawiyro sekwyncyjo DNA kodujōnco shRNA cylujōnce w mysi PCx (5′ 3′) Pod kōntrolōm prōmotora U6, mCherry je używane pod kōntrolōm prōmotora CMV. Produkcyjo pōmocnych wektorōw AAV przekludzōno zgodnie z instrukcyjami producenta (Cell Biolabs). Krōtko godajōnc, użyj transferowego plazmidu, co przenosi mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) przechodnio-transfekcyjo kōmōrki 2MFCAV2). (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) abo Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), jak tyż kodujōncy biōłtko kapsydowe AAV1 i akcesoryjne biōłtko Plazmidowy pakowanie, ze użyciym metody fosforanu wapnia. Surowy supernatant wirusa bōł ôsiōngany bez cykle zamrożynio-rozmrożynio we suchyj łaźni lodu/etanolu i lizowane kōmōrki we fosforanowo buforowanyj sōlnyj wodzie (PBS). Wektōr AAV bōł snożōny bez przerywno ultracyntryfugacyjo gradiyntu jodyksanolu (24 godziny przi 32 000 ôbr/min i 4°C) i kōncyntrowany ze użyciym filtra ultra-15 ôdwirowego Amicon. Miar gynōmu AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 kopije gynōmu (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), wielościowo AAV1-CAG-FLEX bōł zmierzōny tak jak wczasnij (PCR) (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) i AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Piyrwotne neurōny były ôddropane w lodowo zimnym 1x PBS, peletowane, a potym hōmogynizowane w 0,5% Tritōn X-100 / 0,5% dezoksycholanu sodu/buforze lizowym PBS zawiyrajōncym fosfataza i inhibitōr proteaz (Roche). Kwantyfikacyjo biōłtek przekludzōno ze użyciym testu kwasu bicynchōninowego (Thermo Fisher Scientific). Biōtłka były potym rozdzielane ze pōmocōm elektroforezy na żelu SDS-poliakrylamidowym, a potym przemocowane na mymbranie poliwinilidynowo fluoru (GE Healthcare). Blokować niyspecyficzne miyjsca i inkubować z piyrwotnym przeciwtŏłym (patrz tabela S1 do szczegōłōw) w 5% mlyku w TBST (Tris-buforowany soli z Tween), etapach mycio i wtōrnym przeciwtŏłym w TBST Incubate. Inkubować z piyrwotnym przeciwciałym bez noc w tymperaturze +4°C. Po umyciu stosować wtōrne przeciwciało bez 2 godziny w tymperaturze pokojowyj. Niyskorzij, bez inkubacyjo tego samego blotu z przeciwciałym anty-β-aktynowym, to samo ôbciynżynie było potwierdzōne. Wykrywanie bez przekształcynie na chymiluminescencyjo i wzmocniynie chymiluminescencyje (GE Healthcare).
Neurōny wczasnij zasiywane na szklanych pokrywkach były utrwalowane 4% paraformaldehydym (PFA)/PBS w ôkryślōnym pōnkcie czasowym w tymperaturze pokojowyj bez 10 minut. Pokrywki sōm nojprzōd przepuszczane 0,1% Tritōn X-100/PBS bez 5 minut w tymperaturze pokojowyj, a potym w blokujōncym buforze [3% albuminy serum bydła (BSA)/PBS]. Drugigo dnia pokrywki były przemywane blokujōncym buforym i inkubowane z ôdpednim wtōrnym przeciwciałym społōnczōnym z fluoroforym bez 2 godziny w tymperaturze pokojowyj; antlich prōbki były głymboko przemyte we PBS ze 4′,6-diamidino-2 -Fenilindolym (DAPI) je przeciwfarbiōnym, a potym utrwalōnym na ôbłoczkach mikroskopu ze Aqua-Poly/Mount.
Mysze (samce i samice) były zniyszkowane bez wewnōmtrzbrzuszne wstrzykniyncie ketaminy (130 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) i podawane podskōrnie z karprofenym przeciwbōlowym (5 mg/kg) , I wrażane do stereotaktycznego insztrumyntu (Kopd a z pamf). Ôdkryj czaszka i użyj dyntalnego wiyrca, coby roztynżyć tajla skōry mōzgu ôdpowiadajōnco kości mis (z lambdy: ôgōn 1,8, boczny 1, ôdpowiadajōncy płatkōm IV i V). Użyj zakrziwiōnyj igły strzywkowyj, coby ôstrōżnie stworzić mało dziura we czaszce, coby uniknōńć zakłōcanio pōniższych naczyń. Potym cienko szklano kapilar je poleku wkludzano do mikroôtworu (ôd -1,3 do -1 po strōnie brzusznyj dura mater), a 200 do 300 nl AAV je wstrzikniynte do mikroinjektora (Narishige) ze strzywkami manualnymi (Narishige) w ôkresie niskigo ciśniynio do 100. ôkno minut. Po infuzyji wrażać kapilar bez kolejne 10 minut, coby wirus mōg do kōńca rozprzestrzynić sie. Po wychrōniyniu kapilarōw skōra je ôstrōżnie szyto, coby zminimalizować zapalenie rany i dozwolić zwiyrzu na ôdbudowanie sie. Zwiyrzynta były lyczōne analgetykami (kaspofen) bez pora dni po ôperacyji, w czasie kerych jejich stan fizyczny bōł ôstrōżnie mōnitorowany, a potym były eutanizowane we ôkryślōnym mōmyncie czasowym. wszyske procedury były przekludzōne zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjōnalnymi wytycznymi i były zatwierdzōne ôd LandesamtfürNatur z Umwelt i Verbraucherschutz w Pōłnocnym Rajnie-Westfaliji w Niymcach.
Zwiyrzynta były zniyszkowane ketaminōm (100 mg/kg) i ksylazynōm (10 mg/kg), a serce było perfuzowane nojprzōd 0,1 M PBS, a potym 4% PFA w PBS. Tkanka była sekcjōnowano i utrwalowano w 4% PFA/PBS bez noc w tymperaturze 4°C. Wibrujōncy noż (Leica Microsystems GmbH, Wiedyń, Austrijo) bōł użyty do narychtowanio przekrojōw strzelniczych (rubości 50 μm) ze utrwalonego mōzgu we PBS. Bodej, że ôkryślōno inakszyj, farbiynie wolno pływajōncych sekcyji przekludzano było zgodnie z ôpisano powyżyj (13) w tymperaturze pokojowyj i miyszaniu. Krōtko godajōnc, nojprzōd uzyskane placki były permeabilizowane 0,5% Tritōn X-100/PBS bez 15 minut w tymperaturze pokojowyj; w przipadku niykerych epitopōw (Pcx i Shmt2), bez w buforze tris-EDTA w tymperaturze 80°C (PH 9) ôgrzywać plasterki bez 25 minut zamiast tego kroku. Potym sekcyje były inkubowane z piyrwotnym przeciwciałym (patrz tabela S1) we blokujōncym buforze (3% BSA/PBS) w tymperaturze 4°C bez noc przi miyszaniu. Dalszygo dnia sekcyje były przemywane blokujōncym buforym i inkubowane z ôdpednim wtōrnym przeciwciałym społōnczōnym z fluoroforym bez 2 godziny w tymperaturze pokojowyj; antlich sekcyje były dokładnie przemyte we PBS, przeciwfarbiōne DAPI, a potym utrwalōne AquaPolymount Na ôbłoczce mikroskopu.
Do ôbrazowanio prōbki użyto laserowego skaningowego kōnfokalnego mikroskopu (TCS SP8-X abo cyfrowo arkusz światła TCS, Leica Microsystems) wyposażōnego we laser biołego światła i 405-diodowy laser ultrafioletowy. Bez pobudzanie fluoroforu i zbiyranie sygnału ze pōmocōm Hybrid Detector (HyDs), ôprogramowanie LAS-X było użyte do zbiyranio ułożōnych ôbrazōw zgodnych z prōbkowaniym Nyquista w trybie sekwyncyjnym: w przipadku niywielościowych panelōw sōm to barzo dynamiczne sygnały (bez przikłod w kōmōrkach sōmatycznych i dendrytach) dect UFPN w UFPY) mt Tryb BrightR). Do zmyńszynio zadku stosuje sie bramowanie ôd 0,3 do 6 ns.
Ôbrazowanie zortowanych kōmōrek w czasie rzeczywistym. Po zortowaniu we ôstrzodku Neurobasal-A zawiyrajōncym 1% suplementu B27 i 0,5 mM GlutaMax, kōmōrki były zaroz zasiywane na szklanych ôbłoczkach pokrytych poli-l-lizynōm (μ-Slide8 Well, Ibidi, numer katalogu 80826) , a potym utrzimowano je w tymperaturze 1% i CO2. ôsiedlić sie. Ôbrazowanie w czasie rzeczywistym było przekludzane na laserowym skaningowym mikroskopie kōnfokalnym Leica SP8 wyposażōnym we bioły laser, HyD, ôlejny ôbiektyw z 63×[1,4 ôtworōm numerycznōm (NA)] i etap ôgrzywanio.
Mysz była wartko zniyszkowano dwutlynkiym wōnglo i ôdciynto, mōzg bōł wartko usuniynty z czaszki i potniynty na sekcyjo strzelniczo ô rubości 200 μm (do eksperymyntu ôznakowanio 13C) abo 275 μm (do dwōch eksperymyntōw fotōnōw) wypołniōno nastympujōncymi materyjami crece (VHmor56). Scientific, Walldorf, Niymce) je wypołniōny nastympujōncymi substancyjami: 125 mM lodowo zimnych, nasycōnych wōnglym (95% O2 i 5% CO2) niskigo Ca2 + sztucznego płynu mōzgowo-kryngowego (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buferu sodu m2, 1,25 mM buferu sodu, 1,25 mM m2. glukozy, 0,5 mM CaCl2 i 3,5 mM MgCl2 (ciśniynie ôsmotyczne ôd 310 do 330 mmol). Przenieś pozyskane plasterki mōzgu do przedinkubacyjnyj komory zawiyrajōncyj wyższo Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM bufora fosforanu sodu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM Ca2l d-glukozy, 1,0 mM Ca2l MgCl2) Strzednie) pH 7,4 i ôd 310 do 320 mmol).
W czasie procesu ôbrazowanio plasterki były przeniesiōne do wydzielōnego pomieszczynio ôbrazowanio, a eksperymynt przekludzōno pod ciōngłōm perfuzyjōm ACSF we stałyj tymperaturze ôd 32° do 33°C. Do ôbrazowanio przekrojōw użyto wielofotōnowego laserowego skaningowego mikroskopu (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) wyposażōnego we ôbiektyw Leica 25x (NA 0,95, woda), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent). Modul FLIM (PikoHarp300, PikoKwant).
FLIM ôd Grx1-roGFP2. Zmiany w cytōmplazmatycznym stanie redoks PN były mierzōne ze pōmocōm dwufotōnowego FLIM we strzelniczych plackach mōzgu, kaj bioczujnik Grx1-roGFP2 cylowoł PN. W warstwie PN pole pozyskowania je ôbiyrane kole 50 do 80 μm pod powiyrchniōm ôdciynku, coby zapewnić, iże je żywotny PN (to znaczy brak struktury koralicznyj abo zmian morfologicznych neurōnōw wzduż dendrytōw) jak tyż podwōjny pozytywny czujnik roGFP2 kōntrolny i AAVx copresse abo shRNA kodujōncy mWiśnia). Zbiyraj ôbrazy jednostopowe ze 2-krotnym cyfrowym zoomym [dugość wele pobudzynio: 890 nm; 512 nm 512 pikselōw]. Wykrywanie: wnyntrzny HyD, grupa filtrōw izotiocyjanu fluoresceiny (FITC)] i ustrzednianie ôbrazu w czasie 2 do 3 minut sōm używane do zapewniynio, iże zebrano stykajōnco wielość fotōnōw (cuzamyn 1000 fotōnōw) do przifasowanio krzywych. Czułość sōndy Grx1-roGFP2 i weryfikacyjo warōnkōw FLIM były przekludzane bez mōnitorowanie wartości życio roGFP2 przi przidowaniu egzogynicznego 10 mM H2O2 do perfuzyjnego ACSF (coby zmaksymalizować utlyniynie, co skutkuje zwiynkszōnōm ôdpornościōm), a potym przidowanie mretimizo2 redukcyje, co skutkuje zmyńszyniym ôdwłoczności życio) (Figura S8, D do G). Użyj ôprogramowanio FLIMfit 5.1.1 do analizy pozyskanych wynikōw, przifasuj pojedynczo wykładniczo krzywo rozpadu cołkigo ôbrazu do zmierzōnego IRF (funkcyjo ôdpowiedzi insztrumyntu), a χ2 wynosi kole 1. Do ôbliczanio czasu życio pojedynczego PN, maska ​​była strzednio czas życio naôbkoło nerwu . używane do kwantyfikacyje.
Analiza potyncjołu mitochōndrialnego. Po tym, jak ôstre sekcyjo była inkubowano z 100 nM TMRM bezpostrzednio przidowanym do perfuzowanego ACSF bez 30 minut, zmiany potyncjołu mitochōndrialnego PN były mierzōne ze pōmocōm dwufotōnowego mikroskopu. Ôbrazowanie TMRM przekludzano bez pobudzanie sōndy przi 920 nm i użycie wnyntrznego HyD (izotiocyjan tetrametylrodaminy: 585/40 nm) do zbiyranio sygnałōw; bez użycie tyj samyj dugości wele pobudzynio, ale użycie inkszyj wnyntrznyj HyD (FITC :525/50) do ôbrazowanio mtYFP. Użyj pluginu Image Calculator ImageJ do ôcyny potyncjołu mitochōndrialnego na poziōmie pojedynczyj kōmōrki. Krōtko godajōnc, rōwnanie plug-in: sygnał = min (mtYFP, TMRM) je używane do idyntyfikacyje regiōnu mitochōndrialnego, co pokozuje sygnał TMRM w Purkinje Somali w jednostofowym ôbrazie kōnfokalnym ôdpednigo kanału. Potym pola pikselōw w wynikowyj masce je ôkryślano, a potym normalizowano na ôdpednim prōngowym ôbrazie jednostopowym kanału mtYFP, coby uzyskać frakcyjo mitochōndrialno, kero pokozuje potyncjoł mitochōndrialny.
Ôbraz bōł rozwiōnzany ze pōmocōm ôprogramowanio Huygens Pro (Naukowe Ôbrazowanie Ôbjyntości). W przipadku zeskanowanych ôbrazōw dachōwek mōntaż pojedynczyj dachōwki je wykōnowany ze pōmocōm autōmatycznego algorytmu szycio dostarczōnego bez ôprogramowanie LAS-X. Po kalibracyji ôbrazu użyj ImageJ i Adobe Photoshopa do dalszego przetworzanio ôbrazu i jednolitego regulowanio jasności i kōntrastu. Do rychtowanio grafik użyj Adobe Illustratora.
analiza ôgnisko mtDNA. Liczba zmian mtDNA była ôkreślōno na sekcyjach mōzgowych ôznakowanych przeciwciałami przeciwko DNA ze pōmocōm kōnfokalnego mikroskopu. Kożdy docylowy ôbszar bōł stworzōny dlo ciała kōmōrkowego i jōndra kożdyj kōmōrki, a ôdpedni ôbszar bōł porachowany ze pōmocōm plug-inu Multi Measure (ôprogramowanie ImageJ). Ôdjōńć ôbszar jōndrowy ôd ôbszaru ciała kōmōrkowego, coby dostać ôbszar cytōmplazmatyczny. Yntlich, plug-in Analyze Particles (ôprogramowanie ImageJ) bōł użyty do autōmatycznyj kwantyfikacyje pōnktōw cytōmplazmatycznych DNA, co wskozujōm na mtDNA na prōngowym ôbrazie, a uzyskane wyniki były znormalizowane do strzednij PN myszōw CTRL. Wyniki sōm wyrzekane jako strzednio liczba nukleozydōw na kōmōrka.
Analiza ekspresyje biōłtek. Użyj pluginu Image Calculator ImageJ do ôcyny ekspresyje biōłtka w PN na poziōmie pojedynczyj kōmōrki. Krōtko godajōnc, w jednoworsztwowym ôbrazie kōnfokalnym ôdpednigo kanału, bez rōwnanie: sygnał = min (mtYFP, przeciwciało), je zidyntyfikowany regiōn mitochōndrialny, kery wykazuje immunoreaktywność na pewne przeciwciało w Purkina. Potym pola pikselōw we powstałyj masce je ôkryślano, a potym normalizowano na ôdpednim progowym ôbrazie jednostopowym kanału mtYFP, coby uzyskać frakcyjo mitochōndrialno wyświytlanego biōłtka.
Analiza tyngości kōmōrek Purkinje'a. Plug-in Cell Counter z ImageJ bōł użyty do ôcyny tyngości Purkinje'a bez podziylynie liczby rachowanych kōmōrek Purkinje'a bez dugość piestrzynia mōzgowego zajmowanego bez rachowane kōmōrki.
Przigotowanie i pobiyranie prōbek. Mōzgi z grupy kōntrolnyj i myszōw Mfn2cKO były utrwalōne we 2% PFA/2,5% glutaraldehydzie we 0,1 M buforze fosforanowym (PB), a potym sekcyje korōnowe były przigotowane ze użyciym ôczkowych (Leica Mikrosysteme GmbH, Wiedyń, Austrijo) (Rubość utrwalynio μm% do ThePBn tetratlynku i 1,5% ferrocyjanu potasu w tymperaturze pokojowyj bez 1 godzina. Sekcyje były przemywane trzi razy wodōm destylowanōm, a potym farbiōne 70% etanolym zawiyrajōncym 1% octanu uranylu bez 20 minut. Sekcyje były potym ôdwodniōne we stopniowym alkoholu i zagrōniōne we żywicy epoksydowyj Durcupan ACM (żywica ôdlywanio Aralditu M) (Electron Microscopy Sciences, numer katalogu 14040) miyndzy pokrytymi krzymiym szklanych przedmiotōw, a w kōńcu w tymperaturze 60°C polimeryzowane w piecu. Ôbszar skōry mōzgu bōł ôbrany i 50 nm ultracienke sekcyje były wytniynte na Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wiedyń, Austrijo) i ôdbiyrane na 2×1 mm miedziannym necu szczyliny pokrytyj foliōm polistyrylowo. Sekcyje były farbiōne roztworym 4% octanu uranylu w H2O bez 10 minut, przemywane H2O pora razy, potym cytranym ôłowiu Reynoldsa w H2O bez 10 minut, a potym przemywane H2O pora razy. Mikrografy były robiōne ze pōmocōm transmisyjnego mikroskopu elektrōnowego Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ze użyciym cyfrowyj kamery TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Niymce).
U myszōw zainfekowanych AAV mōzg bōł rozdzielōny i pokrojony na 1 mm rubo sekcyjo strzelcowo, a mōzg bōł podszukowany ze pōmocōm mikroskopu fluorescyncyjnego, coby zidyntyfikować piestrzyń zainfekowany AAV (to znaczy eksprymujōncy mCherry). Używo sie ino eksperymyntōw, co w nich injekcyjo AAV powoduje barzo wysoko posiywność transdukcyje worsztwy kōmōrkowyj Purkinje'a (to znaczy bezma cołkij worsztwy) we aby dwōch dalszych piestrzyniach mōzgu. Pynta transdukowano bez AAV była mikrodysekcjōnowano do nocnyj post-fiksacyje (4% PFA i 2,5% glutaraldehydu w 0,1 M buforze kokosowego) i dalij przetworzōno. W przipadku ôsadzanio EPON, utrwalōno tkanka była przemywano 0,1 M buforym kakawowym sodowym (Applichem) i inkubowano z 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) w 0,1 M buforze kakawowym sodowym (Applichem) bez 4 godziny, potym myto bez 2 godziny. Powtōrz 3 razy ze 0,1 M buforem kokamidowym. Niyskorzij rosnōnco seryjo etanolu była użyto do inkubacyje kożdego roztworu etanolu w tymperaturze 4°C bez 15 minut, coby ôdwodnić tkanka. Tkanka była przeniesiōno do tlynku propylenu i inkubowano bez noc w EPON (Sigma-Aldrich) w tymperaturze 4°C. Wklōńć tkanka do świyżego EPON w tymperaturze pokojowyj bez 2 godziny, a potym zagrōbić ja w tymperaturze 62°C bez 72 godziny. Użyj ultramikrotōmu (Leica Microsystems, UC6) i diamentowego noża (Diatome, Biel, Szwajcaryjo) do wytniyńcio 70 nm ultracienkich przekrojōw i farbiynio 1,5% octanym uranylu bez 15 minut w tymperaturze 37°C, a farbiynio roztworym cytrynianu ôłowiu bez 4 minuty. Mikrografyje elektrōnowe były robiōne ze użyciym transmisyjnego mikroskopu elektrōnowego JEM-2100 Plus (JEOL) wyposażōnego we 16-bitowe ôprogramowanie Camera OneView 4K (Gatan) i ôprogramowanie DigitalMicrograph (Gatan). Do analizy mikrografy elektrōnowe były pozyskowane ze cyfrowym zoomym 5000× abo 10 000×.
Analiza morfologiczno mitochōndriōw. Do wszyskich analizōw kōntury pojedynczych mitochōndriōw były ryncznie zarysowowane na cyfrowych ôbrazach ze użyciym ôprogramowanio ImageJ. Analizuje sie roztōmajte parametry morfologiczne. Tyngość mitochōndrialno je wyrzekano jako procynt uzyskany bez podziylynie cołkij powierzchnie mitochōndrialnyj kożdyj kōmōrki bez powierzchnia cytōmplazmy (powierzchnia cytōmplazmy = powierzchnia kōmōrkowo-powierzchnia jōndra kōmōrkowego) × 100. Okrōnglość mitochōndriōw je ôbliczano ze pōmocōm wzoru [4π∙2(powierzchnia)]. Morfologijo ista mitochōndriōw była przeanalizowano i potajlowano na dwie kategoryje (“rułkowe” i “płukowe”) podle jejich głōwnych kształtōw.
Analiza liczby autofagosōmōw/lizosōmōw i tyngości. Użyj ôprogramowanio ImageJ do ryncznego zarysowowanio kōntur kożdego autofagosōmu/lizosōmu na cyfrowym ôbrazie. Powierzchnia autofagosōmu/lizosōmu je wyrzekano jako procynt ôbliczany bez podziylynie cołkij powierzchnie struktury autofagosōmu/lizosōmu kożdyj kōmōrki bez powierzchnia cytōmplazmy (powierzchnia cytōmplazmy=powierzchnia kōmōrkowo-powierzchnia jōndra)×100. Tyngość autofagosōmōw/lizosōmōw je ôbliczano bez podziylynie cołkowityj liczby bez liczba struktur autofagosōmōw/lizosōmōw na kōmōrka (pod wzglyndym powierzchnie cytōmplazmatycznyj) (powierzchnia cytōmplazmatyczne = powierzchnia kōmōrkowo-powierzchnia jōndrowo).
Ôznakowanie do akutego sekcjōnowanio i narychtowanio prōbek. W przipadku eksperymyntōw, co wymogajōm ôznakowanio glukozy, przenieś ôstre plasterki mōzgu do przedinkubacyjnyj komory, co zawiyro nasycōny wōngel (95% O2 i 5% CO2), wysoki Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosforanu sodu m2O, 1,25 mM fosforanu sodu m3O. 25,0 mM d-glukozy, 1,0 mM CaCl 2 i 2,0 mM MgCl 2, przipasowanych do pH 7,4 i 310 do 320 mOsm), w kerych glukoza je 13 C 6- Substytucyjōm glukozy (Eurisotop, numer katalogowy CLM9-1). W eksperymyntach, co wymogajōm ôznakowanio pirogrōnianym, przenieś ôstre plasterki mōzgu do wyższego Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM bufora fosforanu sodu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM Ad2C mM d-glukozy, 1). MgCl2, ustawić do pH 7,4 i 310 do 320 mOsm), i przidać 1 mM pirogrōnianu 1-[1-13C] (Eurisotop, numer katalogowy CLM-1082). Sekcyje inkubujōm bez 90 minut w tymperaturze 37°C. Pod kōniec eksperymyntu sekcyje były wartko przemywane wodnym roztworym (pH 7,4) zawiyrajōncym 75 mM wōnglanu amōniu, a potym hōmogynizowane we 40:40:20 (v:v:v) acetōnitrilu (ACN): metanol: woda. Po inkubowaniu sekcyji na lodzie bez 30 minut, prōbki były ôdwirowane przi 21 000 g bez 10 minut przi 4°C, a przejzdrzisty supernatant bōł suszōny we kōncyntratorze SpeedVac. Powstały suszōny pelet metabolitu bōł przechowowany w tymperaturze -80°C do analizy.
Chrōmatografijo ciekłych-spektrōmetryjo masowo analiza 13 C-znakowanych aminokwasōw. Do analizy ciekłyj chrōmatografije-spektrōmetryje masowyj (LC-MS) pelet metabolitu bōł resuspendowany w 75 μl wody klasy LC-MS (Honeywell). Po ôdwirowaniu przi 21 000 g bez 5 minut w tymperaturze 4°C, 20 μl wyklarowanego supernatantu było użytych do analizy strumiynia aminokwasōw, w czasie kej reszta ekstraktu była zaroz użyto do anijōnowyj analizy (patrz niżyj). Analiza aminokwasōw przekludzōno ze użyciym wczasnij ôpisanego protokołu derywatyzacyje chloru benzoilu (55, 56). W piyrszym etapie 10 μl 100 mM wōnglanu sodu (Sigma-Aldrich) przidano do 20 μl ekstraktu z metabolitōw, a potym 10 μl 2% chloru benzoilu (Sigma-Aldrich) przidano do ACN klasy LC. Prōbka była krōtko wirowano, a potym ôdwirowano przi 21 000 g bez 5 minut przi 20°C. Przenieś ôczyszczōny supernatant do 2-ml fiolki autoprōbkowego ze stożkowōm szklanōm wkłodkōm (ôbjyntość 200 μl). Prōbki były analizowane ze użyciym ultrawysokowydajnego systymu LC (Waters) Acquity iClass połōnczōnego ze wysokorozdzielczościōm precyzyjnego spektrōmetra masowego Q-Exactive (QE)-HF (Thermo Fisher Scientific). Do analizy 2 μl pochodnyj prōbki było wstrzikniynte do 100×1,0 mm wysokowytrzymałyj kolōny T3 (Waters) zawiyrajōncyj tajleczki ô fasōngach 1,8 μm. Przepływ wynosi 100 μl/min, a systym buforowy skłodo sie z bufora A (10 mM mrzynianu amōniu i 0,15% kwasu mrōncznika we wodzie) i bufora B (ACN). Gradiynt je nastympujōncy: 0%B po 0 minutach; 0% B. 0 do 15% B przi 0 do 0,1 minuty; 15 do 17% B w czasie 0,1 do 0,5 minuty; B przi 17 do 55% przi 0,5 do 14 minut; B przi 55 do 70% przi 14 do 14,5 minuty; przi 14,5 do 70 do 100% B po 18 minutach; 100% B po 18 do 19 minutach; 100 do 0% B po 19 do 19,1 minuty; 0% B ôd 19,1 do 28 minut (55, 56). Spektrōmetr masowy QE-HF funguje w trybie dodatnij jōnizacyje z zakresym mas m/z (stosunek masa/ładunek) ôd 50 do 750. Zastosowano rozdzielczość wynosi 60 000, a uzyskany cyl jōnōw kōntrole wzmocniynio (AGC) wynosi 3×106, a maksymalny czas jōnōw millico1. Ôgrzywane zdrzōdło jōnizacyje elektrorozpylanio (ESI) funguje przi napiyńciu rozpylanio 3,5 kV, tymperaturze kapilarnyj 250°C, przepływie luftu pochwy 60 AU (arbitralne jednostki) i pōmocnym przepływie luftu 20 AU. 250°C. Ôbiektyw S je ustawiōny na 60 AU.
Anijōnowo chrōmatografijo-MS analiza kwasōw ôrganicznych ôznakowanych 13C. Ôsad metabolitu (55 μl) bōł analizowany ze użyciym systymu jōnōw chrōmatografije Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) połōnczōnego ze spektrōmetrym masowym QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Krōtko godajōnc, 5 μl ekstraktu z metabolitōw było wstrzikniyntych do kolōny Dionex IonPac AS11-HC wyposażōnyj we HPLC (2 mm×250 mm, miara tajleczek 4 μm, Thermo Fisher Scientific) w trybie wciśniyntyj czynściowyj pyntle z stosunkiym wypołniynio 1. 4μm, Termo Fishera Naukowo). Tymperatura kolōny je utrzimowano na 30°C, a autoprōbnik je ustawiōny na 6°C. Do wygynerowanio gradiyntu wodorotlynku potasu bez gyneratōr eluyntu użyj kartuszki wodorotlynku potasu zabezpieczōnyj dejōnizowanym wodōm. Rozdzielanie metabolitōw przi przepływie 380μl/min, przi zastosowaniu nastympujōncego gradiyntu: 0 do 3 minut, 10 mM KOH; ôd 3 do 12 minut, ôd 10 do 50 mM KOH; ôd 12 do 19 minut, ôd 50 do 100 mM KOH; 19 do 21 minut , 100 mM KOH; 21 do 21,5 minut, 100 do 10 mM KOH. Kolōmna była zaś wyrōwnoważōno pod 10 mM KOH bez 8,5 minuty.
Eluowane metabolity sōm łōnczōne ze strumiyniym suplementu izopropanolu ô 150 μl/min po kolōnie, a potym skerowane do spektrōmetra masowego ô wysokij rozdzielczości, co funguje w trybie ujymnyj jōnizacyje. MS mōnitorowo zasiyng mas ôd m/z 50 do 750 z rozdzielczościōm 60 000. AGC je ustawiōny na 1×106, a maksymalny czas jōnōw je utrzimowany na 100 ms. Ôgrzywane zdrzōdło ESI działało przi napiyńciu rozpylanio 3,5 kV. Inksze ustawiynia zdrzōdła jōnōw sōm nastympujōnce: tymperatura kapilarno 275°C; przepływ gazu pochwy, 60 AU; pōmocny przepływ gazu, 20 AU przi 300°C, a ustawiynie ôbiektywu S na 60 AU.
Analiza danych metabolitōw ôznakowanych 13C. Do analizy danych relacyje izotopōw użyj ôprogramowanio TraceFinder (wersyjo 4.2, Thermo Fisher Scientific). Tożsamość kożdego zwiōnzku była zweryfikowano bez niezawodny zwiōnzek ôdniysiynio i niyznoleżnie przeanalizowano. Do przekludzynio analizy zbogacynio izotopōw, pola ekstrahowanego jōnowego chrōmatogramu (XIC) kożdego izotopu 13C (Mn) była ekstrahowano z [M + H] +, kaj n je liczba wōnglo docylowego zwiōnzku, używano do analizy aminokwasōw abo [ MH] + je używano do analizy anijōnōw. Akuratność masowo XIC wynosi myńszo jak piyńć czynści na milijōn, a akuratność RT wynosi 0,05 minuty. Analiza zbogacynio je przekludzano bez ôbliczanie stosunku kożdego wykrytego izotopu do sumy wszyskich izotopōw ôdpednigo zwiōnzku. Te relacyje sōm podane jako procyntowe wartości do kożdego izotopu, a wyniki sōm wyrzekane jako procyntowe zbogacynie molarne (MPE), jak ôpisano wczasnij (42).
Zamrożōny pelet neurōnōw bōł hōmogynizowany w lodowo zimnym 80% metanolu (v/v), wirowany i inkubowany w tymperaturze -20°C bez 30 minut. Prōbka zaś wirować i miyszać przi +4°C bez 30 minut. Prōbka była ôdwirowano przi 21 000 g bez 5 minut przi 4°C, a potym powstały supernatant bōł zebrany i suszōny ze użyciym kōncyntratora SpeedVac przi 25°C do niyskorniyjszyj analizy. Jak ôpisano powyżyj, analiza LC-MS przekludzōno na aminokwasach zortowanych kōmōrek. Ze użyciym TraceFinder (wersyjo 4.2, Thermo Fisher Scientific) analiza danych była przekludzōno ze użyciym mōnoizotopowyj masy kożdego zwiōnzku. Kwantylowo normalizacyjo danych metabolitōw przekludzōno ze użyciym pakietu ôprogramowanio preprocessCore (57).
Przigotowanie plackōw. Mysz była wartko zniyszkowano dwutlynkiym wōnglo i ôdciynto, mōzg bōł wartko usuniynty z czaszki, a wypołniōny lodym wibrujōncy nōż (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Niymce) bōł użyty do przekrojanio jij na 300 do 375% gazowych se2 Col5 CO2) Niski Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM bufora fosforanu sodu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukozy, 1,0 mM CaCl2 i 6,0 mM MgCl301 do pH. mOSm). Przenieś pozyskane plasterki mōzgu do komory zawiyrajōncyj wyższe Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM bufora fosforanu sodu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM pH7C d-glukozy, 4,0 mM Mm Ca32l) i ôd 310 do 320 mOSm). Przechowuj placki bez 20 do 30 minut, coby mogły być prziwrōcōne przed nagraniym.
nagrowanie. Do wszyskich nagraniōw użyto biny mikroskopu wyposażōnyj we stało nagrowanio kōmora i 20-krotno ôbiektyw zanurzynio we wodzie (Scientifica). Przijmowane kōmōrki Purkinje'a były zidyntyfikowane podle (i) srogości ciała, (ii) anatōmicznyj lokalizacyje mōzgu i (iii) ekspresyje fluorescyncyjnego gynu reportera mtYFP. Pipeta plastra ô ôdporności kōńca ôd 5 do 11 megohmōw je wyciōngano bez kapilar borokrzymianowy szklany (GB150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Niymce) i poziōmo pipeta Instruments (P-1000). wszyske nagrania były wykōnowane bez wzmacniacz ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Niymce), co bōł kōntrolowany bez ôprogramowanie Signal (wersyjo 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Wielgo Brytanijo). Eksperymynt bōł nagrany przi tympom prōbkowanio 12,5 kHz. Sygnał je filtrowany ze pōmocōm dwōch krōtkoprzepustowych filtrōw Bessela ô frekwyncyjach ôdciyńcio ôdpednio 1,3 i 10 kHz. Pojymność mymbrany i pipety je rykōmpynsowano bez ôbwōd kōmpōnsacyjny ze użyciym wzmacniacza. wszyske eksperymynta były przekludzane pod kōntrolōm kamery Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Niymce), co była kōntrolowano ôd ôprogramowanio Hokawo (wersyjo 2.8, Hamamatsu, Gerden, Niymce).
Rutynowo kōnfiguracyjo i analiza cołkij kōmōrki. Zaroz przed nagraniym wypołnij pipeta roztworym wnyntrznym zawiyrajōncym nastympujōnce substancyje: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM glukōnian potasu, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM GufanoTPGte5g (4,0 mM ATP.TPG5g) (Na) i 10,0 mM fosforanu kreatyniny były sprowniōne do pH 7,25, a ciśniynie ôsmotyczne wyniosło 290 mOsm (sacharoza). Zaroz po zastosowaniu siyły 0 pA do przerywanio błōny zmierzōno potyncjoł błōny spoczynkowyj. Ôpor wejściowy je mierzōny bez zastosowanie hiperpolaryzowanych strumynōw -40, -30, -20 i -10 pA. Zmierz srogość ôdpowiedzi napiyńcio i użyj prawa Ohma do ôbliczanio ôporu wejściowego. Spōntaniczno aktywność była registrowano we zaciśniyńciu napiyńciowym bez 5 minut, a sPSC było zidyntyfikowane i mierzōne we Igor Pro (wersyjo 32 7.01, WaveMetrics, Jezioro Oswego, Oregon, USA) ze użyciym pōłautomatycznego skryptu rozpoznowanio. Krzywo IV i strumiyń stacjōnarny sōm mierzōne bez zaciśniyńcie baterije przi roztōmajtych potyncjołach (poczōnwszy ôd -110 mV) i zwiynkszanie napiyńcio w krokach ôd 5 mV. Produkcyjo AP była testowano bez zastosowanie strumiynia depolaryzujōncego. Zaciśnij kōmōrka przi -70 mV w czasie zastosowanio impulsu depolaryzujōncego strumiynia. Reguluj srogość kroku kożdyj jednostki nagrowanio ôsobno (10 do 60 pA). Ôblicz maksymalno frekwyncyjo AP bez rynczne rachowanie szpic impulsowych, co powodujōm nojwyższo frekwyncyjo AP. Prōg AP je analizowany ze użyciym drugij pochodnyj impulsu depolaryzacyje, kery nojprzōd wyzwalo jedyn abo wiyncyj AP.
Kōnfiguracyjo i analiza perforowanych plastrōw. Przekludź nagrowanie perforowanych plastrōw ze użyciym sztandardowych protokołōw. Użyj pipety bez ATP i GTP, kero niy zawiyro nastympujōncych skłodnikōw: 128 mM glukōnianu K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA i 2 mM MgCl2, i przisztymować do pH 7,2 (z użyciym KOH). ATP i GTP sōm pōminiynte z roztworu wewnōntrzkōmōrkowego, coby zapobiyc niykōntrolowanyj przepuszczalności błōny kōmōrkowyj. Pipeta plastra je wypołniano roztworym wnyntrznym zawiyrajōncym amfoterycyna (kole 200 do 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), coby dostać dźwigniynty zopis plastra. Amfoterycyna była rozpuszczano we siarczanku dimetylu (ôstateczne stynżynie: ôd 0,1 do 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Kōncyntracyjo użytego DMSO niy miała żodnego znaczōncego wpływu na badane neurōny. W czasie procesu dźwiganio ôdporność kanału (Ra) była sztyjc mōnitorowano, a eksperymynt bōł rozpoczōnty po stabilizacyji ampitudy Ra i AP (20-40 minut). Spōntaniczno aktywność je mierzōno we zaciśniyńciu napiyńcio i/abo prōmiyniowego bez 2 do 5 minut. Analiza danych była przekludzōno ze użyciym Igora Pro (wersyjo 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excela (wersyjo 2010, Korporacyjo Microsoft, Redmond, USA) i GraphPad Prism (wersyjo 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornijo). Stany Zjednoczōne). Do idyntyfikacyje spōntanicznych AP je używany wtyczka NeuroMatic v3.0c ôd IgorPro. Autōmatycznie idyntyfikować AP ze pōmocōm danego progu, co je regulowany indywidualnie dlo kożdego zopisu. Przi użyciu interwału skoku ôkryśl frekwyncyjo skoku z maksymalnōm niyzawodnōm frekwyncyjōm skoku i strzedniōm frekwyncyjōm skoku.
Izolacyjo PN. Bez przipasowanie sie do wczasnij ôpublikowanego protokołu, PNs były snożōne z mysiego mōzgu na ôkryślōnym etapie (58). Krōtko godajōnc, mōzg bōł sekcjōnowany i mlyty w lodowo zimnym ôstrzodku dysocjacyjnym [bez HBSS Ca2+ i Mg2+, dopołniōnym 20 mM glukozōm, pynicylinōm (50 U/ml) i streptōmycynōm (0,05 mg/ml)] ( / ml), papaina (16 U / ml) i dezoksyrybōnukleaza I (DNaza I; 0,1 mg/ml)] Ôbsudzać bez 30 minut w tymperaturze 30°C. Nojprzōd umyć tkanki we ôstrzodku HBSS zawiyrajōncym śluz jajowy (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) i DNaza (0,1 mg/ml) w tymperaturze pokojowyj, coby zapobiyc trowiyniu ynzymatycznym, a potym we ôstrzodku HBSS zawiyrajōncym 20 mM glukozy), delikatnie młynōnc we HBmylm5 (0,05 mg/ml) i DNaza (0,1 mg/ml) uwolniajōm pojedyncze kōmōrki. Powstało suspensyjo kōmōrkowo była przefiltrowano bez 70μm sitko kōmōrkowe, potym kōmōrki były peletowane bez ôdwirowanie (1110 ôbr/min, 5 minut, 4°C) i resuspendowane we ôstrzodku zortowym [HBSS, dopołniōny 20 mM glukozōm, 20% płodowyj stremyliny bydła) Serum, (0,05 mg/ml)]; ôcynić żywotność kōmōrek ze pōmocōm jodu propidu i przipasować tyngość kōmōrek do 1×106 do 2×106 kōmōrek/ml. Przed cytōmetryjōm przepływowōm suspensyjo była przefiltrowano bez 50 μm sitko kōmōrkowe.
Cytōmetr przepływu. Sortowanie kōmōrek przekludzano w tymperaturze 4°C ze użyciym masziny FACSAria III (BD Biosciences) i ôprogramowanio FACSDiva (BD Biosciences, wersyjo 8.0.1). Suspensyjo kōmōrkowo była zortowano ze użyciym dyszy ô ôbjyntości 100 μm pod ciśniyniym 20 psi przi tympie ~2800 zdarzyń/sek. Pōniywoż tradycyjne kryteria bramowanio (srogość kōmōrek, dyskryminacyjo bimodalno i karakterystyka rozproszanio) niy mogōm zapewnić noleżnyj izolacyje PN ôd inkszych zortōw kōmōrek, strategijo bramowanio je ustanowiano na podstawie bezpostrzednigo porōwnanio intynsywności YFP i autofluorescyncyje w mitoYFP+ ​​i kōntrolnym mitoYFP - MitoYFP. YFP je pobudzane bez naprōmiyniowanie prōbki 488 nm linijōm laserowōm, a sygnał je wykrywany ze pōmocōm filtra przepustowego 530/30 nm. U mysi mitoYFP+ ​​zglyndno siyła gynu reportera Rosa26-mitoYFP je tyż używano do ôdrōżnianio ciała neurōnowego i fragmyntōw aksōnōw. 7-AAD je pobudzony ze pōmocōm żōłtego lasera ô ôdmiarze 561 nm i wykrywany ze pōmocōm filtra przepustowego ôd 675/20 nm, coby wykluczyć martwe kōmōrki. Coby we tym samym czasie ôddzielić astrocyty, suspensyjo kōmōrkowo była farbiōno ACSA-2-APC, potym prōbka była naprōmiyniowano 640 nm linijōm laserowōm, a do wykrycio sygnału użyto filtra przepustowego 660/20 nm.
Zebrane kōmōrki były peletowane bez ôdwirowanie (1110 ôbr/min, 5 minut, 4°C) i przechowowane w tymperaturze -80°C do użycio. Mysze Mfn2cKO i jejich szczyńki sōm klasyfikowane w tym samym dniu, coby zminimalizować zmiynność proceduralno. Prezyntacyjo i analiza danych FACS były przekludzōne ze użyciym ôprogramowanio FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Jak spōmniano powyżyj (59), PCR w czasie rzeczywistym je używane do izolowanio DNA z zortowanych neurōnōw do niyskorniyjszyj kwantyfikacyje mtDNA. Lynijowitość i progowo czułość były nojprzōd testowane bez przekludzynie qPCR na roztōmajtyj liczbie kōmōrek. Krōtko godajōnc, zebrać 300 PN w buforze lizowym, co skłodo sie z 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 i biōłtkazy K (200 ng/ml) i inkubować w tymperaturze 55°C bez 120 minut. Kōmōrki były dalij inkubowane w tymperaturze 95°C bez 10 minut, coby zapewnić kōmpletno inaktywacyjo biōłtkazy K. Ze użyciym sōndy TaqMan (Thermo Fisher) specyficznyj dlo mt-Nd1, mtDNA było mierzōne ze pōmocōm pōłwielkościowego PCR w systymie PCR Ficientimoshera w czasie rzeczywistym 7900HT (Ther). Nauka, numer katalogowy Mm04225274_s1), gyny mt-Nd6 (termofishera naukowo, numer katalogu AIVI3E8) i 18S (termofishera naukowo, numer katalogu Hs99999901_s1).
Przigotowanie prōbki proteōmu. Bez ôgrzywanie roztworu w tymperaturze 95°C bez 10 minut i ultrasōnowane, w buforze lizy [6 M chloru guanidyny, 10 mM chloru fosfiny tris(2-karboksytylo), 10 mM chloroacetamidu i 100 mM tris-HC zamrożōnym neurōnie]. Na Bioruptor (Diagenod) bez 10 minut (30 sekund impulsu / 30 sekund ôkresu pauzy). Prōbka była roztworzōno 1:10 we 20 mM tris-HCl (pH 8,0), zmiyszano ze 300 ng trypsinowego złota (Promega) i inkubowano bez noc w tymperaturze 37°C, coby ôsiōngnōńć imyntne trowiynie. Drugigo dnia prōbka była ôdwirowano przi 20 000 g bez 20 minut. Supernatant bōł roztworzōny 0,1% kwasym mrōnczym, a roztwōr bōł ôdsolōny ze pōmocōm samotworzōnych StageTips. Prōbka była suszōno we insztrumyncie SpeedVac (kōncyntratōr Eppendorfa plus 5305) w tymperaturze 45°C, a potym peptyd bōł zawieszōny we 0,1% kwasie mrōnczym. wszyske prōbki były przigotowane we tym samym czasie ôd tyj samyj ôsoby. Do analizy prōbek astrocytōw, 4 μg ôdsolōnych peptydōw było ôznakowanych tandymowym znakiym masowym (TMT10plex, numer katalogu 90110, Thermo Fisher Scientific) ze stosunkiym peptydu do ôdczynnika TMT 1:20. Do ôznakowanio TMT 0,8 mg ôdczynnika TMT było resuspendowane w 70 μl bezwodnego ACN, a wysuszōny peptyd bōł zrekōnstytuowany w 9 μl 0,1 M TEAB (biwōnglany trietylamōnium), do kerego przidano 7 μl ôdczynnika TMT w ACN. Kōncyntracyjo wyniosła 43,75%. Po 60 minutach inkubacyje ryakcyjo była zgasniynto 2 μl 5% hydroksylaminy. Znakowane peptydy były zebrane, wysuszōne, resuspendowane w 200 μl 0,1% kwasu mrziwnego (FA), potajlowane na dwa, a potym ôdsolōne ze pōmocōm samotworzōnych StageTips. Przi użyciu ultra wysokowydajnego chrōmatografu ciekłych UltiMate 3000 (ultra wysokowydajny chrōmatograf ciekłych UltiMate 3000), jedna z dwōch pōłowy była frakcjōnowano na chrōmatograficznyj kolōnie Acquity ô fasōngach 1 mm x 150 mm wypołniōnyj tajleczkami C18 ô fasōngach 130 Å1,7 μm (NoWaters, katalog160). Termo Fishera Naukowo). Ôddzielać peptydy przi przepływie 30μl/min, ôddzielać ôd 1% do 50% bufora B bez 85 minut z krokowym gradiyntym 96 minut, ôd 50% do 95% bufora B bez 3 minuty, potym 8 minut dlo 95% bufora B; Bufer A to 5% ACN i 10 mM biwōnglanu amōniu (ABC), a bufer B to 80% ACN i 10 mM ABC. Zbiyrać frakcyje co 3 minuty i łōnczyć je w dwie grupy (1 + 17, 2 + 18, itp.) i suszyć je we prōzniowyj ôdwirowyj fudze.
Analiza LC-MS/MS. W przipadku spektrōmetryje masowyj peptydy (liczba r119.aq) były rozdzielane na kolōnie analitycznyj PicoFrit ô 25 cm i 75 μm wewnyntrznyj strzednicy (nowo ôbiektywno ôbiektywa, numer czynści PF7508250) wyposażōnyj we 1,9 μm ôstrzodka ReproSil-Pur C82), EASY-nLC 1200 (termofishera naukowo, Niymce). Kolōmna była utrzimowano w tymperaturze 50°C. Bufery A i B to ôdpednio 0,1% kwasu mrziwnego we wodzie i 0,1% kwasu mrziwnego w 80% ACN. Peptydy były ôddzielane ôd 6% do 31% bufora B bez 65 minut i ôd 31% do 50% bufora B bez 5 minut z gradiyntym 200 nl/min. Eluowane peptydy były analizowane na spektrōmetrze masowym Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Miara m/z prekursora peptydu je przekludzano z rozdzielczościōm 120 000 w zakresie ôd 350 do 1500 m/z. Przi użyciu 27% znormalizowanyj ynergije zderzyniowyj, nojsiylniyjszy prekursor ze stanym ładunku ôd 2 do 6 je ôbiyrany do rozszczypianio dysocjacyje trap C (HCD) ô wysokij ynergiji. Czas cyklu je ustawiōny na 1 s. Werta m/z fragmyntu peptydowego była mierzōno we jōnowyj puście ze użyciym nojmyńszego cylu AGC 5×104 i maksymalnego czasu wstrzikniyńcio 86 ms. Po fragmyntacyji prekursor bōł umiyszczōny na dynamicznyj liście wykluczynio bez 45 s. Peptydy ôznakowane TMT były rozdzielane na 50-cm, 75-μm kolōnie Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, numer katalogu 164942), a widma migracyje były analizowane na spektrōmecie masowym Orbitrap Lumos jako spektrōmetrym masowym z wysokim formym wadōnku. (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) funguje przi dwōch napiyńciach kōmpensacyjnych -50 i -70 V. MS3 ôbrany na podstawie prekursora synchronizacyje je używany do pōmiary sygnału jōnowego TMT. Separacyjo peptydōw przekludzōno na EASY-nLC 1200, ze użyciym 90% elucyje lynijowyj gradientu, ze stynżyniym bufora ôd 6% do 31%; bufer A bōł 0,1% FA, a bufer B bōł 0,1% FA i 80% ACN. Kolōmna analityczno je ôperacyjno w tymperaturze 50°C. Użyj FreeStyle (wersyjo 1.6, Thermo Fisher Scientific), coby potajlować ôryginalny plik podle napiyńcio kōmpōnsacyjnego FAIMS.
Idyntyfikacyjo i kwantyfikacyjo biōłtek. Ze użyciym zintegrowanego wyszukownika Andrōmeda ôryginalne dane były przeanalizowane ze użyciym MaxQuant wersyje 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Ôkrōm sekwyncyjōw rekōmbinazy Cre i YFP uzyskanych z Aequorea victoria, spektra fragmyntōw peptydowych były poszukowane po nojlepszyj sekwyncyji i sekwyncyji izoformy mysiego proteōmu ôdniesiynio (Proteōm ID UP000000589, pobrany z UniProt w mŏju2). Utlyniynie metioniny i acetylacyjo N-terminalno biōłtka były ustawiōne za zmiynne modyfikacyje; metylacyjo cysteiny karbamoylu była ustawiōno za stałe modyfikacyje. Parametry trowiynio sōm ustawiōne na “specyficzność” i “trypsyna/P”. Minimalno liczba peptydōw i peptydōw brzitwowych używanych do idyntyfikacyje biōłtek wynosi 1; minimalno liczba unikalnych peptydōw wynosi 0. W warōnkach sztimu karty peptydōw spōłczynnik idyntyfikacyje biōłtka wyniōs 0,01. Ôpcyjo “Drugi peptyd” je włōnczōno. Użyj ôpcyje “pasu miyndzy wykōnaniami” do przeniesiynio podarzōnych idyntyfikacyji miyndzy roztōmajtymi ôryginalnymi plikami. Użyj minimalnego rachowanio stosunku LFQ 1 do kwantyfikacyje bez ôznakowanio (LFQ) (60). Intynsywność LFQ je filtrowano dlo aby dwōch ważnych wertōw w aby jednyj grupie gynotypu w kożdym pōnkcie czasowym i je ekstrapolowano ze normalnego porozkłodanio ô szyrokości 1. 0,3 i przejdź w dōł 1,8. Do analizy wynikōw LFQ użyj platformy ôbliczaniowyj Perseus i R (projekt.org/). Do rōżnicowyj analizy ekspresyje użyto dwudyrekcyjnego strzednigo testu t z pakietu ôprogramowanio limma (61). Eksploracyjno analiza danych je przekludzano ze użyciym ggplot, FactoMineR, faktoekstra, GGally i pheatmap. Dane proteōmiki ôparte na TMT były analizowane ze użyciym wersyje MaxQuant 1.6.10.43. Poszukowanie surowych danych proteōmicznych z bazy danych proteōmiki ludzkij UniProt, co była pobrano we wrześniu 2018 roku. Analiza ôbyjmuje spōłczynnik korekcyje czystości izotopōw dostarczōny ôd producenta. Użyj limma w R do rōżnicowyj analizy ekspresyje. Ôryginalne dane, wyniki poszukowanio w bazie danych jak tyż przepływ roboty i wyniki analizy danych sōm przechowywane we sojuszu ProteomeXchange bez repozytorium partnerskigo PRIDE z idyntyfikatorym zbioru danych PXD019690.
Funkcjōnalne adnotacyje zbogacajōm analiza. Norzyńdzie analizy sztreki sprowności (QIAGEN) było użyte do ôkryślynio bogactwa terminōw funkcjōnalnyj adnotacyje zbioru danych po 8 tydniach (Figura 1). Krōtko godajōnc, wielościowy wykŏz biōłtek uzyskany z analizy danych LC-MS/MS (spektrōmetryjo masowo tandymowo) je używany z nastympujōncymi kryteriami filtra: Mus musculus je ôbrany za gatōnek i zadku, a kategoryjo pokozuje, iże wert P sprowniōny bez Benjamini do zbogacynio 0,05 abo niższy je uwożany za znaczōncy. Dlo tego wykresu pokozano piyńć nojlepszych kategoryji nadbytku w kożdym klastrze podle sprowniōnego wertu P. Ze użyciym wielokrotnego t-testu, ze użyciym dwustopniowego programu lynijowego zwiynkszanio ôd Benjaminiego, Kriegera i Yekutieliego (Q = 5%), analiza ekspresyje biōłtka w czasie je przekludzano na wożnych kandydatach zidyntyfikowanych w kożdyj kategoryji, a kożdo raje je analizowane ôsobno. Niy ma potrzeby przijmowanio spōjnego SD.
Coby porōwnać wyniki tego podszukowanio z ôpublikowanymi bazami danych i wygynerować diagram Venna na figurze 1, połōnczyli my wielościowy wykŏz biōłtek z adnotacyjami MitoCarta 2.0 (24). Do wygynerowanio diagramu użyj internetowego norzyńdzio Narysuj diagram Venna (http://bioinformatyka.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Po szczegōłowe informacyje na tymat statystycznych procedur używanych do analizy proteōmicznyj, proszōm ôdniesiyć sie do ôdpednij sekcyje Materyji i Metody. Dlo wszyskich inkszych eksperymyntōw szczegōłowe informacyje idzie znojś we ôdpednij powiarce. Bodej, że ôkryślōno inakszyj, wszyske dane sōm wyrzekane jako strzednie ± SEM, a wszyske statystyczne analizy były przekludzōne ze użyciym ôprogramowanio GraphPad Prism 8.1.2.
Coby zapoznać sie z ekstra materyjami do tego artykułu, patrz http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/35/6/eaba8271/DC1.
Je to artykuł z ôtwartym dostympym dystrybuowany na warōnkach Licyncyje Creative Commons Attribution-Non-Commercial, co przizwolo na użycie, dystrybucyjo i reprodukcyjo w leda jakim medium, podwiela ôstateczne użycie niy ma dlo kōmercyjnego zysku, a założyniym je to, iże ôryginalno robota je noleżno. Ôdniesiynie.
Napomniynie: Prosimy ino ô podanie twojigo adresu e-mail, coby ôsoba, kerõ rekōmyndujesz na strōna, wiedziała, iże chcesz, coby zoboczyła e-mail i że to niyma spam. Niy chwytamy żodnych adresōw e-mail.
To pytanie je używane do przetestowanio, eli jesteś gościym i do zapobiyganio autōmatycznymu przesyłaniu spamu.
Ôd E. Motoriego, I. Atanasowa, SMV Kochana, K. Folza-Donahue'a, V. Sakthiwelu, P. Giavalisco, N. Tōniego, J. Pujala, N.-G. Larsōn
Analiza proteōmiczno dysfunkcjōnalnych neurōnōw pokozała, co programy metaboliczne sōm aktywowane do przeciwdziylanio neurodegyneracyji.
Ôd E. Motoriego, I. Atanasowa, SMV Kochana, K. Folza-Donahue'a, V. Sakthiwelu, P. Giavalisco, N. Tōniego, J. Pujala, N.-G. Larsōn
Analiza proteōmiczno dysfunkcjōnalnych neurōnōw pokozała, co programy metaboliczne sōm aktywowane do przeciwdziylanio neurodegyneracyji.
©2020 Amerykański Stowarziszynie dlo Postympu Nauki. wszyske prawa zastrzeżōne. AAAS je partnyrym ôd HINARI, AGORI, OARE, CHORU, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. Postympy Nauki ISSN 2375-2548.