Teroźny†Teroźny adres: OX11 0DE, Wielgo Brytanijo, Diamond Building, Park Nauki i Innowacyje Harwella, Dietcote, Oksfordshire, Wielgo Brytanijo, Diamond Light Source Co., Ltd., Cyntrum Elektronicznego Ôbrazowanio Biologicznego.
Kōmpleks zbiyrajōncy światło w cyntrum reakcyje 1 (RC-LH1) je podstawowym skłodnikiym fotosyntytycznym fioletowych bakteryjōw fototroficznych. Wkludziyli my dwie struktury krioelektrōnowyj mikroskopije kōmpleksu RC-LH1 z Rhodopseudomonas palustris. Struktura rozdzielczości 2,65 Å kōmpleksu RC-LH114-W skłodo sie z 14 podjednostkowych pył LH1 ôbtoczajōncych RC, kere sōm przerwane bez biōłtko W, w czasie kej kōmpleks bez biōłtka-W je blank skłodym RC ôbtoczōnym RC. Zawarte 16 podjednostki LH1 pylta. Porōwnanie tych struktur dostarczo wglōndu na dynamika chinōnōw w kōmpleksie RC-LH1, w tym wczasnij niyôkryślōne zmiany kōnformacyjne przi łōnczyniu chinōnōw w miyjscu RC QB, jak tyż lokalizacyjo pōmocnych miyjsc łōnczynio chinōnōw, kere pōmogajōm przekozać je do RC. Unikalno struktura biōłtka W zapobiygo zawrziciu pyntle LH1, tworzōnc w tyn spōsōb kanał do przispiyszanio umiany chinōnōw/chinōnōw.
Ynergijo dostarczano ôd fotosyntezy może podtrzimać bezma cołke życie na Ziymi, a tyż mo srogi potyncjoł dlo słōnecznyj biotechnologije. Prōmujōnc globalno fotosynteza, fioletowe bakteryje fototroficzne wykazujōm tyż roztōmajte zorty ynergije i zdolności metaboliczne. Mogōm unikać fotosyntezy i rosnōńć jako heterotroficzne bakteryje we ćmawości, mogōm utrwalować azot i dwutlynek wōnglo, produkować wodōr i rozkłodać zwiōnzki arōmatyczne (1-3). Coby zapewnić ynergijo do tych procesōw, światło musi być wartko i ôptymalnie przekształcane we chymiczno ynergijo. Tyn proces zaczyno sie, kej kōmpleks antyny chwytajōncyj światło pochłōnio światło i przenosi uwiynziōno ynergijo do cyntrum reakcyje (RC), a tym samym zaczyno rozdzielanie ładunkōw (4 – 7). Bazowo jednotka fotosyntezy u fioletowych bakteryjōw fototroficznych skłodo sie z RC zorty 2, ôbtoczōnyj kōmpleksym zbiyrajōncym światło 1 (LH1), tworzōnc kōmpleks jōndrowy RC-LH1. LH1 tworzi sie bez szereg zakrziwiōnych heterodymerōw αβ, z kerych kożdy łōnczy dwie czōnsteczki bakteryjnego chlorofilu (BChl) i jedyn abo dwa karotenoidy (8-12). Nojprostszo antyna LH1 skłodo sie z 16 abo 17 heterodymerōw αβ ôbtoczajōncych RC (9-13) we zawrzityj pyntle, ale w inkszych kōmpleksach jōndrowych peptydy transbłōnnowe przerywajōm ciōngłość ôbtoczajōncego LH1 , prōmujōnc w tyn spōsōb dyfuzyjo chinolu/chinonu i kōmpoks1 bRC1 ( 13-15). Fioletowo roślina fototroficzno Rhodopseudomonas (Rps.) je ôrganizmym modelowym, kery może zrozumieć przenoszynie ynergije i elektrōnōw, kere spōmogajōm fotosynteza. Piyrszo struktura krystaliczno Rps. Modelym kōmpleksu palustris RC-LH1 je RC, ôbtoczōny 15 heterodymerycznymi pyłami LH1, kere sōm przerwane bez niyznōme biōłtko zwane “Biōłtkym W” (14). Biōłtko-W było niyskorzij zidyntyfikowane za RPA4402, kere je niyscharakteryzowane biōłtko ô ôbjyntości 10,5 kDa z trzema przewidowanymi spiralami transbłōnnowymi (TMH) (16). Propōnujemy przemianowanie gynu rpa4402 kodujōncego biōłtko W na pufW, coby bōł zgodliwy z nōmynklaturōm używanōm do gynōw kodujōncych podjednostki RC-L, M (pufL, pufM) i LH1α, β (pufA, pufB). Co ciekawe, biōłtko-W je ôbecne ino w kole 10% RC-LH1, co pokozuje Rps. palustris produkuje dwa roztōmajte kōmpleksy RC-LH1. Tukej ôdnotowujymy wysokorozdzielczościowe struktury krio-EM (cryo-EM) dwōch kōmpleksōw jōndrowych, jednego z biōłtkym W i 14 heterodymerami αβ, drugigo bez biōłtka W i zawrzityj pyntle LH1 16 heterodymerōw. Naszo struktura reprezyntuje krokowo pōmiana w rozumiyniu kōmpleksu RC-LH1 Rps. palustris, pōniywoż przeanalizowali my hōmogyniczno populacyjo kożdego wariantu i majymy stykajōnco rozdzielczość, coby klarownie przipisać kożdy peptyd i zwiōnzane pigmynta jak tyż pokrewne lipidy i chinōny. Porōwnanie tych struktur pokozuje, iże trzi biōłtka TMH-W, kere dotychczas niy były znojdziōne w żodnym inkszym kōmpleksie RC-LH1, gynerujōm kanał chinōnowy do przispiyszynio umiany chinōnōw/chinōnōw. Zidyntyfikowano mocka zachowanych miyjsc łōnczynio lipidōw i chinōnōw, a my wykozali nowo pōmiana kōnformacyjno po kōmbinacyji chinōnōw i RC, kero może być ôdpowiednio do fotosystymu II (PSII) RC tlyniōnych ôrganizmōw fototroficznych. Nasze ôdkrycia dowajōm nowe wglōndy na kinetyka wiōnzanio i wymiany chinōnōw/chinōnōw w kōmpleksie jōndrowym RC-LH1 fioletowych bakteryjōw fototroficznych.
Coby ułacnić szczegōłowe podszukowanie dwōch kōmpleksōw znojdziōnych w Rps. palustris, izolujymy kożdy RC-LH1 metodami biochymicznymi. Kōmpleks biōłtka z niydostatkiym W (dalij ôkryślany za ΔpufW) bōł snożōny ze szczypu pozbytego gynu pufW (16), a ino jedyn kōmpleks RC-LH1 może być wyprodukowany. Kōmpleks zawiyrajōncy biōłtko W je produkowany ôd szczypu. Biōłtko W tego szczypu je modyfikowane ze 10-krotnym znakiym His na jego C-krańcu, tak iże kōmpleks zawiyrajōncy biōłtko W mōg być skutecznie połōnczōny z wiynkszościōm brakujōncym biōłtkym W bez uniemobilizacyjo metalu. Kōmpleks je skutecznie rozdzielōny (16) Chrōmatografijo powinowactwo (IMAC).
Jak pokozano na figurze 1, ôba kōmpleksy zawiyrajōm trzi podjednostki RC (RC-L, RC-M i RC-H) ôbtoczōne antynōm LH1. Struktura 2,80-A kōmpleksu bez biōłtka-W wykazuje 16 heterodymerōw αβ, tworzōnc zawrzito pylta LH1, kero blank ôbtoczo RC, dalij ôkryślano za kōmpleks RC-LH116. Struktura 2,65 Å kōmpleksu zawiyrajōncego biōłtko W mo 14-heterodymer LH1 przerwany bez biōłtko W, dalij ôkryślany za RC-LH114-W.
(A i B) Reprezyntacyjo powiyrchniowo zwiōnzku. (C i D) Połōnczōne pigmynta eksprymowane we patyczkach. (E i F) Kōmpleksy ôbserwowane z powiyrchnie cytōmplazmatycznyj majōm peptydy i podjednostki LH1 reprezyntowane we kreskōwkach i sōm numerowane we kerōnku wajzrōw zygora ôd luki biōłtko-W [spōjne z numeracyjōm Rba. kōmpleks sferoidōw (13)]. W przipadku LH1-α farba podjednostki biōłtka je żōłto; w przipadku LH1-β farba podjednostki biōłtka je modro; w przipadku biōłtka-W biōłtko je czerwōne; w przipadku RC-H je to cyan; do RC-L, to je Apluzinowo; do RC-M, purpurowy. Kofaktory sōm reprezyntowane bez patyczki, zielōny reprezyntuje czōnsteczki BChl i BPh a, fioletowy reprezyntuje karotenoidy, a żōłty reprezyntuje czōnsteczki UQ10. (G i H) Powiynkszōny widok luki biōłtko-W w rōwnowożnym regiōnie kōmpleksu RC-LH114-W (G) i kōmpleksu RC-LH116 (H). Kofaktory sōm wykazowane we formie wypołniynio przestrzyństwa, chelowany chinōn je wykazowany na modro. Luka biōłtko-W je podświytlano błynkitnōm kreskowanōm linijōm we (G), a małe dziury, w kerych dyfunduje chinōn/chinol na piestrzyniu LH116, sōm podświytlane czornōm kreskowanōm linijōm we (H).
Figura 1 (A i B) pokozuje RC ôbtoczōny ôdewrzōnymi abo zawrzitymi macierzimi heterodymerōw LH1αβ, z kerych kożdy łōnczy dwa BChl i jedyn karotenoid (Figura 1, C i D). Piyrwyjsze badania wykozały, iże Rps je kōmpleksym LH1. Na sztrece biosyntytycznyj ksantyny spiruliny te gatōnki zawiyrajōm miyszane populacyje karotenoidōw (17). Jednak spiropirroksantyna je dōminujōncym karotenoidym, a jeji tyngość je kōntyntuujōnco. Bez to ôbiyrali sie modelować spiroksantyna we wszyskich miyjscach łōnczynio LH1. Polipeptydy alfa i beta to pojedyncze TMH z krōtkimi błōnnymi zewnyntrznymi regiōnami (Figura 1, A, B, E i F). Chocioż niy zaôbserwowano tyngości 17 resztōw na krańcu C, polipeptyd alfa bōł rozszczypiōny z Met1 do Ala46 w ôbōch kōmpleksach. polipeptyd β bōł zredukowany z Gly4 do Tyr52 w RC-LH116, a z Ser5 do Tyr52 w RC-LH114-W. Niy zaôbserwowano tyngości 3 abo 4 N-kōńcowych abo 13 C-kōńcowych resztōw (Figura S1). Analiza spektrōmetryje masowyj miyszanego kōmpleksu RC-LH1 stworzōnego ze szczypu dzikij zorty pokozała, iże brakujōncy regiōn bōł wynikym heterologicznego rozszczypianio tych peptydōw (Figura S1 i S2). Zaôbserwowano tyż N-kōńcowo formylacyjo α-Met1 (f). Analiza wykozała, iże α-peptyd skłodo sie z resztōw fMet1 do Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, a β-peptyd skłodo sie z resztōw Ser2 do Ala53, co je we dobryj zgodzie z kartōm tyngości EM w niskij tymperaturze.
Koordynacyjo α-His29 i β-His36 sprawio, iże BChls sōm gymba w gymba; kożdy heterodymer αβ łōnczy sie ze swojimi sōmsiadōm, tworzōnc ôtwartŏ pylta (RC-LH114-W) abo zawrzito pylta (RC-LH116) naôbkoło RC Tablica pigmyntōw sprzyngniyntych z ekcytōnami (Figura 1, C i D). W porōwnaniu z 877 nm pasym RC-LH114-W, 880 nm czerwōnego pochłōnianio RC-LH116 wynosi 3 nm (Figura 2A). Jednak widmo ôkrōngłego dichroizmu je bezma take samo (Figura 2B), co wskozuje na to, iże chocioż je klarowno rōżnica miyndzy ôdewrzōnymi i zawrzitymi pytlami, lokalne strzodowisko BChls je barzo podobne. Przesuniyńcie czerwōnyj absorpcyje może być wynikym zmyńszōnego ruchu termicznego i zwiynkszōnyj stabilności na zawrzityj pyntle (18, 19), pōmiany sprzōntanio pigmyntowego sprawiōnyj bez zawrzito pyntle (20, 21) abo kōmbinacyje tych dwōch efektōw (11).
(A) Widmo pochłōnianio ultrafioletowe/widzialne/bliskopodczerwiyń, kerego szpice sōm ôcychowane ôdpednimi pigmyntami i znormalizowane do szpice BPh przi 775 nm. (B) Widmo ôkrōngłego dichroizmu znormalizowane do pochłōnialności BChl przi 805 nm. (C i D) Wybrane widma ΔA ze widma absorpcyje z rozwiōnzaniym czasowym kōmpleksu RC-LH114-W (C) i kōmpleksu RC-LH116 (D). Dlo lepszyj porōwnowalności wszyske widma sōm normalizowane do ∆A ôd -A przi 0,2 ps. (E) Tympo utlyniynio cytochrōmu c2 po naprōmiyniowaniu w ôbecności roztōmajtych stynżyń UQ2 (patrz figura S8 do surowych danych). (F) W kōmōrkach chowanych pod światłym niskij, strzednij abo wysokij intynsywności (ôdpednio 10, 30 abo 300μMm-2 s-1), podjednostki biōłtka W i RC-L w ôczyszczōnym kōmpleksie i stosunek rozdzielōnyj błōny. Ôkryślynie poziōmu biōłtka bez elektroforeza na żelu SDS-poliakrylamidowym i immunotestu (patrz figura S9, coby zoboczyć surowe dane). Określ stosunek wzglyndym ôczyszczōnego kōmpleksu RC-LH114-W. Stosunek steichiōmetryczny RC-L do biōłtka-W kōmpleksu wynosi 1:1.
BChl na pozycyji 1 we zdeformowanyj pyntle αβ14 RC-LH114-W (Figura 1, A, C i E) sōm bliżyj piyrwotnego dowcy RC (P) ô 6,8 Å aniżeli rōwnowożne BChl w RC-LH116 (Figura 1, B, D); jednak przechodnio kinetyka pochłōnianio tych dwōch kōmpleksōw pokozuje, iże w przipadku RC-LH114-W i RC-LH116 stałe czasowe przenoszynio ynergije pobudzynio z LH1 do RC wynoszōm 40 ±4 i 44±3 ps (Figura 2). , C i D, Figura S4 i Tabulka S2). Niy ma tyż znaczōncyj rōżnice w transferze elektrōnicznym w ôbrymbie RC (Figura S5 i pokrewny ekstra tekst). Podejzdrzywōmy, iże blisko zgodliwość czasu przenoszynio ynergije miyndzy LH1 a RC-P wyniko z podobnyj ôdległości, kōntu i ynergije potyncjołōw wiynkszości BChl w dwōch pytlach LH1. Wydowo sie, iże eksploracyjo mustra ynergije LH1 do ôsiōngniyńcio minimalnyj ôdległości niy ma warcij aniżeli bezpostrzedni transfer ynergije z suboptymalnych miyjsc do RC. Pynta LH1 z ôdewrzōnōm pętlōm w RC-LH114-W może tyż przejść niyznaczōncy ruch termiczny w warōnkach niskij tymperatury do analizy strukturalnyj, a istnieje dugszo kōnformacyjo piestrzynia αβ14 w tymperaturze pokojowyj ôd ôdległości pigmyntacyje βBChl w pozycyji RC 1.
Kōmpleks RC-LH116 zawiyro 32 BChl i 16 karotenoidōw, a jego ôgōlne ukłod je taki sōm, jak ukłod pozyskany z pidpidum Thermochromatium (Tch.) [Banka Danych Biōłtkowych (PDB) ID 5Y5S (9), tiorhodowibrio ID9T9T9r. (12) i zielōne algi (Blc.viridis) (ID PDB 6ET5) (10). Po wyrōwnaniu zaôbserwowano ino małe ôdchylynia w pozycyjach heterodymerōw αβ, ôsobliwie 1-5, 15 i 16 (Figura S6). Ôbecność biōłtka-W mo srogi wpływ na struktura LH1. Jeji trzi TMH sōm połōnczōne bez krōtke pyntle, z N-terminalnym po strōnie lumenu kōmpleksu i C-terminalnym po strōnie cytōmplazmatycznyj (Figurki 1A i 3, ôd A do D). Biōtłko-W je w srogij miarze hydrofobowe (Figura 3B), a TMH2 i TMH3 wchodzōm w interakcyjo z LH1αβ-14, tworzōnc powiyrchnia transbłōnnowo (Figura 3, B i E do G). Granica skłodo sie głōwnie z resztōw Phe, Leu i Val w regiōnie transbłōnnowym. Te resztoki sōm ułożōne hydrofobowymi aminokwasami i pigmyntami αβ-14. Do interakcyje prziczyniajōm sie tyż niykere reszto polarne, w tym wiōnzanie wodorowe miyndzy W-Thr68 i β-Trp42 na powiyrchni słożōnyj wnōntrza (Figura 3, F i G). Na powiyrchni cytōmplazmy Gln34 je prziległy do ​​ketogrupy karotenoidōw αβ-14. Ôkrōm tego czōnsteczka n-dodecylu β-d-maltozydu (β-DDM) była rozwiōnzano, a jeji hydrofobowy ôgōn rozciōngoł sie do granicy miyndzy biōłtkym-W i αβ-14, a ôgōn lipidowy może być zlokalizowany w ciałach. Zauważyli my tyż, iże regiōny C-terminalne rozdzielczości biōłtka W i RCH sōm barzo bliske, ale niy w zakresie tworzynio ôkryślōnych interakcyjōw (Figura 1, A i E). Jednak w niyrozwiōnzanych aminokwasach C-kōńcowych tych dwōch biōłtek mogōm wystympować interakcyje, kere mogōm stanowić mechanizm rekrutacyje biōłtka-W w czasie tworzynio kōmpleksu RC-LH114-W.
(A) Biōłtko-W, kere je skerowane na graniczka z LH1αβ14 we formie kreskōwki, mo lyńcuch boczny we formie sztyngla (czerwōny), wykazowany w czynści diagramu potyncjołu elektrostatycznego (przejzdrzisto szaro powiyrchnia ô poziōmie linijowym 0,13). (B) Biōłtko-W reprezyntowane bez hydrofobowo kolorowano powiyrchnia. Ôbszary polarne i nafolowane sōm przedstawiōne w kolorze cyan, ôbszary hydrofobowe sōm przedstawiōne w kolorze biołym, a mocno hydrofobowe ôbszary sōm przedstawiōne w kolorze apluzinowym. (C i D) Biōłtko-W reprezyntowane we kreskōwce, jego ôriyntacyjo je ta sama jak w (A) (C) i ôbrōcōno ô 180° (D). Zgodnie z pozycyjōm we sekwyncyji, wyrōżnialne resztki przijmujōm schymat farbōw dyngi, kaj N-terminal je modry, a C-terminal je czerwōny. (E) Biōłtko-W w tym samym poglōńdzie jak w (A), a resztki na granicy biōłtka-W:LH1 sōm reprezyntowane bez sztyngle z prziłōnczōnymi znakami. (F) Biōłtko-W je ôbrōcane ô 90° wzglyndym (E) i LH1αβ14 w reprezyntacyji kreskōwki, jak tyż wzglyndym resztōw interfejsu w reprezyntacyji szynkōw. Nawieszajōnce resztki z polipeptydu beta sōm ôznakowane. Kofaktōr je pokozany jako słupek ôdpowiadajōncy farbie na figurze 1, rozkłodany β-DDM je pokozany na szarym, a tlyn je pokozany na czerwōno. (G) Widok w (F) je ôbrōcōny ô 180°, z widzialnymi resztami ôznakowanego polipeptydu alfa.
Biōłtko-W zastympuje heterodymer αβ (15. na figurze 1F), zapobiygo w tyn spōsōb zawrziciu pyntle i nachylyniu piyrszych trzech heterodymerōw αβ. Zaôbserwowano, iże maksymalny kōnt nachylynio piyrszego heterodymeru αβ-1 wzglyndym normalnyj filmu bōł ôd 25° do 29° (Figura 1, A i E), kery powstoł bez nachylynie αβ-1 ôd 2° do 8° w RC A ôstrym kōntrastym-LH116 i F. 1, B). Drugi i trzeci heterodymer sōm pochylōne ôdpednio ôd 12° do 22° i ôd 5° do 10°. Skuli sterycznyj utrudniynio RC, nachylynie αβ-1 niy ôbyjmuje drugij pory αβ (kero ôdpado 16. αβ na figurze 1F), tworzōnc tōż klarowno luka w piestrzyniu LH1 (figura 1, A i E) . Skuli braku dwōch heterodymerōw αβ, w połōnczyniu z utratōm sztyrech BChl i dwōch karotenoidōw, żodyn z karotenoidōw niy łōnczy sie ze skrōcōnōm podjednostkōm αβ-1, co skutkuje piestrzyniym LH114-W zawiyrajōncym 13 karotenoidōw wegetariańskich i 28 BChl. Szacōnki lokalnyj rozdzielczości dwōch kōmpleksōw w regiōnach αβ1 do 7 sōm niższe aniżeli te w resztie pyntle LH1, co może ôdzwierciedlać niyôdłōnczno plastyczność podjednostki LH1 prziległyj do miyjsca RC QB (Figura 4) .
Ôbrazy RC-LH114-W (A i B) i RC-LH116 (C i D) sōm pokozane z tego samego widoku wiyrchu/boku (A i B) (A i C) i powiyrchnie wnōntrza na fig. 1. (B i D). Farbiste klawisze sōm pokozane po prawyj zajcie.
Jedynym inkszym karakterystycznym kōmpleksym jōndrowym ô stosunku steichiōmetrycznym 1:14 je dimer RC-LH1-PufX rodokoku sferoidowego (Rba.) (13). Jednak biōłtka W i PufX niy majōm ôczywistyj hōmologije i majōm znaczōncy wpływ na jejich ôdpednie struktury LH1. PufX je pojedynczym TMH z N-kōńcowōm dōmynōm cytōmplazmatycznōm, kero wchodzi w interakcyjo ze strōnōm cytōmplazmatycznōm podjednostki RC-H (13) w pozycyji ôdpednij Rps. ôd ôdbytu LH116αβ-16. PufX tworzi kanał do wymiany chinōnōw/chinōnōnōw miyndzy RC-LH1 a kōmpleksym cytochrōmu bcl i je ôbecny we cołkim Rba. kōmpleks jōndrowych sferoidōw (13). Chocioż granica mōnōmer-mōnōmer je w Rba. Dimer sphaeroidōw RC-LH1-PufX je zlokalizowany w pozycyji łōnczynio biōłtka W w RC-LH114-W, a luka indukowano bez PufX i biōłtko-W je w rōwnowożnyj pozycyji (Figura S7A). Luka w RC-LH114-W je tyż wyrōwnano z hipotytycznym kanałym chinōnowym (8) Pseudomonas rosea LH1, kery je tworzōny bez peptydy niypowiōnzane z biōłtkym W abo PufX (Figura S7B). Ôkrōm tego kanał chinōnowy w Blc. Smaragdowo-zielōny LH1 utworzōny bez wykluczynie jednyj podjednostki γ (7) je umiyszczōny w podobnym położyniu (Figura S7C). Chocioż pośredniczōne bez roztōmajte biōłtka, ukōnanie sie tych kanałōw chinōnowych/chinolowych we spōlnym położyniu we kōmpleksie RC-LH1 zdowo sie być przikładym ewolucyje zbieżnyj, co wskazuje na to, iże luka utworzōno bez biōłtko W może fungować za kanał chinōnowy.
Luka we pyntle LH114-W przizwolo na tworzynie sie ciōngłego regiōnu błōnnowego miyndzy przestrzyniōm wnyntrznōm kōmpleksu RC-LH114-W a błōnōm ôgōlnōm (Figura 1G), zamiast łōnczynio tych dwōch dōmyn bez pora biōłtkowo, jak w biōłtkach. Kōmpleks RC-LH116 je podobny do zawrzitego Tch. Kōmpleks igłopodobny (22) (Figura 1H). Pōniywoż dyfuzyjo chinonu bez błōna je warcij aniżeli dyfuzyjo bez ciasny kanał biōłtkowy, ôdewrzōno pylta LH114-W może przizwolić na gibszy ôbrōt RC aniżeli zawrzito pylta LH116, a dyfuzyjo chinonu do RC może być barzij ôgraniczōno. Coby przebadać, eli biōłtko W wpływo na kōnwersyjo chinōnōw bez RC, przekludziyli my test utlyniynio cytochrōmu na pewnym stynżyniu ubichinōnu 2 (UQ2) (analog naturalnego UQ10 z krōtszym izoprenu ôgōnym) (Figura 2E). Chocioż ôbecność chelowanego chinōnu zawodzo akuratnymu ôkryślyniu złudnyj stałyj Michaelisa (RC-LH114-W i RC-LH116 sōm ôdpowiednie do ôdpednio 0,2±0,1μM i 0,5±0,2μM), maksymalne tympo RC-LH114-6W wynosi s. 28±5% srogsze aniżeli RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Przōdzi ôszacowali my, iże biōłtko-W je ôbecne w kole 10% kōmpleksu jōndrowego (16); tutaj spōłczynniki zajyntości kōmōrek wzrōstu w niskim świetle, strzednim i wysokim świetle wynoszōm ôdpednio 15±0,6%, 11±1% i 0,9±0,5 % (Figura 2F). Wielościowe porōwnanie spektrōmetryje masowyj wykozało, iże przidanie znacznika histydyny niy zmyńszyło zglyndnyj hojności biōłtka-W w porōwnaniu ze szczypami dzikij zorty (P = 0,59), tōż te poziōmy niy sōm artefaktym zmodyfikowanego biōłtka-W (Figura S10). Jednak ta nisko zajyntość biōłtka-W w kōmpleksie RC-LH1 może przizwolić niykerym RC na ôdwrocanie sie w przispiyszonym tympie, co łagodzi wolniyjszo wymiana chinōnōw/chinōnōw w kōmpleksie RC-LH116. Zauważyli my, iże wysoki wskoźnik zajyntości światła je niyspōjny z ôstatnimi danymi transkryptōmicznymi, co wskazuje na to, iże ekspresyjo gynu pufW wzrosto pod siylnym światłym (Figura S11) (23). Rōżnica miyndzy transkrypcyjōm pufW a inkorporacyjōm biōłtka-W do kōmpleksu RC-LH1 je mylōnco i może ôdzwierciedlać słożōno regulacyjo biōłtka.
W RC-LH114-W przidzielo sie 6 kardiolipiny (CDL), 7 fosfatydylcholiny (POPC), 1 fosfatydylglicerolu (POPG) i 29 czōnsteczek β-DDM i modeluje sie w nim 6 CDL, 24 POPC, 2 POβDM i 12. RC-LH116 (Figura 5, A i B). W tych dwōch strukturach CDL je bezma po strōnie cytōmplazmatycznyj kōmpleksu, w czasie kej POPC, POPG i β-DDM sōm z wiynksza po strōnie luminalnyj. Dwie czōnsteczki lipidowe i detergyntu były wyizolowane w regiōnie αβ-1 do αβ-6 kōmpleksu RC-LH114-W (Figura 5A), a piyńć było wyizolowanych w rōwnowożnym regiōnie RC-LH116 (Figura 5B ). Po drugij zajcie kōmpleksu znojdziōno było wiyncyj lipidōw, głōwnie CDL, grōmadzōnych miyndzy RC a αβ-7 do αβ-13 (Figura 5, A i B). Inksze strukturalnie rozwiōnzane lipidy i detergynty sōm zlokalizowane poza piestrzyniym LH1, a dobrze rozwiōnzane lyńcuchy acylowe rozciōngajōm sie miyndzy podjednostkami LH1, roboczo ôkryślōnymi za β-DDM w RC-LH114-W i definiowanymi za β-DDM w RC A miszōngu βPOPC-DHDM i 166. Podobne położynia chelatujōncych lipidōw i detergentōw w naszyj strukturze wskazujōm, iże sōm ône fizjologicznie istotnymi miyjscami łōnczynio (Figura S12A). Pozycyje rōwnowożnych czōnsteczek w Tch majōm tyż dobro kōnsekwyncyjo. Łagodny i Trv. Szczyp 970 RC-LH1s (Figura S12, B do E) (9, 12) i resztki wiōnżōnce wodōr grupy gowy lipidowyj wykozały doś dobre zachowanie w wyrōwnaniu sekwyncyje (Figura S13), co wskozuje na to, iże Zachowany CDL, kery łōnczy sie z RC (24), te miyjsca mogōm być zachowane w compxL1.
(A i B) Peptydy RC-LH114-W (A) i RC-LH116 (B) sōm reprezyntowane bez kreskōwki, a pigmynta sōm przedstawiōne bez patyczki, przi użyciu schymatu farbōw na figurze 1. Lipidy sōm pokozane na czerwōno, a detergenty na szarym. UQ zwiōnzany z miyjscami RC QA i QB je żōłty, w czasie kej izolowany UQ je modry. (C i D) Te same poglōndy jak (A) i (B), z pōminiyntym lipidami. (E do G) Powiynkszōny widok Q1(E), Q2(F) i Q3(G) z RC-LH116, z lyńcuchami bocznymi, co wpływajōm na siebie nawzajym. Wiōnzania wodorowe sōm pokozane jako czorne kreskowane linije.
W RC-LH116 tak RC QA jak i QB UQ, kere uczestniczōm w transferze elektrōnōw w procesie separacyje ładunkōw, sōm rozkłodane we swojich miyjscach łōnczynio. Jednak w RC-LH114-W chinōn QB niy bōł rozwiōnzany i bydzie szczegōłowo ômōwiōny niżyj. Ôkrōm chinōnōw QA i QB, dwie chelowane czōnsteczki UQ (zlokalizowane miyndzy piestrzyniami RC i LH1) sōm przidzielane we strukturze RC-LH114-W zgodnie z jejich dobrze rozdzielōnymi grupami gowy (zlokalizowanymi ôdpednio w Q1 i Q2). przestrzyństwo). Figura 5C). Dwie jednostki izoprenu sōm przipisowane do Q1, a karta tyngości rozwiōnzuje kōmpletne 10 ôgōnōw izoprenu Q2. We strukturze RC-LH116 były rozwiōnzane trzi chelowane czōnsteczki UQ10 (Q1 do Q3, figura 5D), a wszyske czōnsteczki majōm klarowno tyngość w cołkim ôgōnie (Figura 5, D do G). W dwōch strukturach pozycyje grup gowy chinōnōw Q1 i Q2 majōm perfekt kōnsystyncyjo (Figura S12F), a ône wchodzōm w interakcyjo ino z RC. Q1 je umiyszczōny na wejściu do ôtworu W RC-LH114-W (Figura 1G i 5, C, D i E), a Q2 je umiyszczōny w bliżu miyjsca łōnczynio QB (Figura 5, C, D) i F). Zachowane reszto L-Trp143 i L-Trp269 sōm barzo bliske Q1 i Q2 i zapewniajōm potyncjalne interakcyje π-stacking (Figura 5, E i F, jak tyż Figura S12). L-Gln88, 3,0 Å ôd dystalnego tlynu Q1, zapewnio mocne wiōnzanie wodorowe (Figura 5E); tyn reszt je zachowany we wszyskich RC z wyjōntkym nojbarzij ôdległyj relacyje (Figura S13). L-Ser91 je kōnserwatywnie zastōmpiōny Thr we wiynkszości inkszych RC (Figura S13), wynosi 3,8 Angstrōmōw ôd tlynu metylowego Q1 i może zapewniać słabe wiōnzania wodorowe (Figura 5E). Q3 niy zdowo sie mieć specyficznyj interakcyje, ale je zlokalizowany w regiōnie hydrofobowym miyndzy podjednostkōm RC-M a podjednostkōm LH1-α ôd 5 do 6 (Figura 5, D i G). Q1, Q2 i Q3 abo pobliske chelowane chinōny były tyż rozwiōnzane w Tch. Łagodny, Trv. Szczyp 970 i Blc. Struktura ôd ôdblaski (9, 10, 12) skazuje na zachowane pōmocne miyjsce łōnczynio chinōnōw w kōmpleksie RC-LH1 (Figura S12G). Piynć rozkłodanych UQ w RC-LH116 je w dobryj zgodzie z 5,8±0,7 kożdego kōmpleksu ôkryślōnym bez wysokowydajno chrōmatografijo ciekłych (HPLC), w czasie kej trzi rozkłodane UQ w RC-LH114-W sōm niższe aniżeli zmierzōno wartość 6,2±theQ wskazuje, iże niy rozwiōnzane sōm S4 (Fig. struktura.
Kożdy z pseudosymetrycznych polipeptydōw L i M zawiyro piyńć TMH i tworzi heterodymer, kery łōnczy ze sobōm jedyn dymer BChl, dwa mōnōmery BChl, dwa mōnōmery bakteryjofagōw (BPh) jak tyż jedna abo dwie czōnsteczki UQ10. Dziynki ôbecności wiōnzań wodorowych na grupie czetōnowyj kōńcowyj i jejich znanyj akumulacyji w Rps, karotenoidy sōm włōnczōne do podjednostki M, kero nosi miano cis-3,4-dehydrororodopiny. Gatōnki (25). Dōmyna zewnyntrznyj błōny RC-H je zakotwiczōno do błōny bez pojedynczy TMH. Ôgōlno struktura RC je podobno do trzech podjednostek RC pokrewnych gatōnkōw (takich jak Rba). sferoidy (ID PDB: 3I4D). Makrocykle BChl i BPh, szkeletu karotenoidowego i żelaza niyhemowego nakłodajōm sie na siebie w zakresie rozdzielczości tych struktur, podobnie jak grupa gowowo UQ10 w miyjscu QA i chinōn QB w RC-LH116 (Figura S15).
Dostympność dwōch struktur RC z roztōmajtymi stopniami zajyntości miyjsca QB dowo nowo szansa na podszukowanie stałych zmian kōnformacyjnych towarziszōncych wiōnzaniu chinōnōw QB. W kōmpleksie RC-LH116 chinōn QB je zlokalizowany w połni zwiōnzanyj pozycyji “proksymalnyj” (26), ale separacyjo RC-LH114-W niy mo chinōnu QB. W RC-LH114-W niy ma chinōnu QB, co je udziwiajōnce, pōniywoż kōmpleks je aktywny, barzij aniżeli kōmpleks RC-LH116 z strukturalnie rozwiōnzanōm chinōnōm QB. Chocioż dwa piestrzynie LH1 chelatujōm kole sześciu chinōnōw, piyńć je strukturalnie rozwiōnzanych w zawrzitym piestrzyniu RC-LH116, w czasie kej ino trzi sōm strukturalnie ôgraniczōne w ôdewrzōnym piestrzyniu RC-LH114-W . To zwiynkszōne zaburzynie strukturalne może ôdzwierciedlać gibszo zastōmpiynie miyjsc QB RC-LH114-W, gibszo kinetyka chinōnōw w kōmpleksie i zwiynkszōne prawdopodobiyństwo przekroczynio pyntle LH1. Sugerujymy, iże brak UQ w miyjscu RC QB RC-LH114-W może być wynikym barzij słożōnego i barzij aktywnego kōmpleksu, a miyjsce QB RC-LH114-W było zaroz zamrożōne w ôbrocie UQ Specyficzno etapa (wejście do miyjsca QB było zawrzite kōnformacyjo) ref.
Bez QB towarzyszōnce ôbrot L-Phe217 do pozycyje, kere je niyspōjne z wiōnzaniym UQ10, pōniywoż powoduje to zderzynie przestrzynne z piyrszōm jednostkōm izoprenu ôgōna (Figura 6A). Ôkrōm tego ôczywiste sōm ôczywiste głōwne zmiany kōnformacyjne, ôsobliwie helisa de (krōtko helisa we pyntle miyndzy TMH D i E), kaj L-Phe217 je przesuniynty do kejsy wiōnżōncyj QB i ôbrot L-Tyr223 (Figura 6A ) Coby przełōnczyć wiōnzanie wodorowe z rōmōm wiōnżōncym QB i rōmōm wiōnżōncego M-4. miyjsce (Figura 6B). Helix de pivots u jeji podstawy, Cα L-Ser209 je przesuniynty ô 0,33 Å, w czasie kej L-Val221Cα je przesuniynty ô 3,52 Å. Niy ma ôbserwowalnych zmian w TMH D i E, kere sōm nałożōne w ôbōch strukturach (Figura 6A). Na jak wiymy, je to piyrszo struktura w naturalnym RC, kero zawrzi miyjsce QB. Porōwnanie z kōmpletnōm (zwiōnzanōm z QB) strukturōm pokozuje, co przed redukcyjōm chinōnu potrzebno je pōmiana kōnformacyjno, coby ôn weszōł do chinōnu. L-Phe217 ôbrōco sie, tworzōnc interakcyjo π-stacking z grupōm gowowōm chinōnōw, a helisa przesuwo sie na zewnōntrz, co przizwolo szkeletowi L-Gly222 i lyńcuchu bocznymu L-Tyr223 na tworzynie necu wiōnzań wodorowych ô sztabilnyj strukturze wiōnzań wodorowych (Figura 6, A i C).
(A) Nakłodajōnco sie na siebie kreskōwka struktury hologramu (lyńcuch L, apluzinowy/M, purpurowy) i apo (szaro), w keryj resztki kluczowe sōm wykazowane we formie reprezyntacyje podobnyj do sztyngla. UQ10 je reprezyntowany bez żōłty słupek. Kropkowano linijo skazuje na wiōnzania wodorowe utworzōne we cołkij strukturze. (B i C) Reprezyntacyjo powiyrchniowo apolipobiōłtka i cołkij struktury piestrzyniowyj, podkreślajōnc ôdpednio tlyn lyńcucha bocznego L-Phe217 na modro i L-Tyr223 na czerwōno. Podjednostka L je apluzinowo; podjednostki M i H niy sōm ôfarbiōne. (D i E) Apolipobiōłtka (D) i cołke (E) miyjsca RC QB [ôdpednio farba bez (A)] i Thermophilus Termophilus PSII (zielōny, błynkitny z plastycznym chinōnym; ID PDB: 3WU2) Wyrōwnać (58).
Niyôczekiwanie, chocioż dostympne je pora struktur RC z niydostatkiym QB bez LH1, zmiany kōnformacyjne zaôbserwowane w tym badaniu niy były wczasnij ôgłoszōne. Noleżōm do nich struktura deplecyje QB z Blc. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), czyr. ôd środka (ID PDB: 1EYS) (28) i Rba. sferoidōw (PDB ID: 1OGV) (29), kere wszyske sōm bezma take same jak jejich ôgōlno struktura QB. Blisko kōntrola 3PRC pokozała, iże czōnsteczki detergyntu LDAO (tlynk laurylu dimetylaminy) łōnczōm sie przi wejściu do pozycyje QB, co może zapobiyc przeułożyniu sie w zawrzito kōnformacyjo. Chocioż LDAO niy rozkłodo sie w tym samym miyjscu w 1EYS abo 1OGV, te RC sōm rychtowane ze użyciym tego samego detergentu, a bezto mogōm wywołować taki sōm efekt. Struktura krystaliczno Rba. Sphaeroides RC spōłskrystalizowane z cytochrōmym c2 (PDB ID: 1L9B) tyż zdowo sie mieć zawrzite miyjsce QB. Jednak w tym przipadku regiōn N-terminalny polipeptydu RC-M (interakcyje z miyjscym łōnczynio QB bez wiōnzanie H reszty Tyr na helice Q) przijmuje niynaturalno kōnformacyjo, a pōmiana kōnformacyjno QB niy ma dalij podszukowano (30 ). Co je uspokojajōnce, to je to, iże niy widzieli my tyj zorty deformacyje polipeptydu M we strukturze RC-LH114-W, kero je bezma ta sama jak N-kōńcowy regiōn RC-LH116 RC. Noleży tyż dojzdrzeć, iże po eradykacyji antyny LH1 ôpartyj na detergentach rozwiōnzano było apolipoproteinowe RC w PDB, co wyeliminowało wnyntrzne bazy chinōnōw i lipidy w ôtworu miyndzy RC a wewnyntrznōm powiyrchniōm ôbtoczajōncego piestrzynia LH1 (31, 32). RC ôstowo funkcjōnalny, pōniywoż zachowuje wszyske kofaktory, z wyjōntkym rozkłodalnego chinōnu QB, kery je mynij sztabilny i czynsto je stracōny w czasie procesu narychtowanio (33). Ôkrōm tego wiadōmo, iże usuniyńcie LH1 i naturalnych cyklicznych lipidōw z RC może mieć wpływ na funkcyje, take jak skrōcōno ôdporność stanu P+QB rozdzielōnego ôd ładunku (31, 34, 35). Bez to spekulujymy, iże istniynie lokalnego piestrzynia LH1 ôbtoczajōncego RC może utrzimać “zawarte” miyjsce QB, zachowujōnc w tyn spōsōb lokalne strzodowisko w bliżu QB.
Chocioż apolipoproteina (bez chinōnu QB) i cołko struktura reprezyntujōm ino dwa migawki ôbrōtu miyjsca QB, a niy seryjo zdarzyń, sōm wskazania, iże wiōnzanie może być zawrzite, coby zapobiyc powtornymu wiōnzaniu sie bez hydrochinōna Coby hamować hamowanie substratu. Interakcyjo chinololu i chinonu w bliżu miyjsca QB apolipoproteina może być inkszo, co prowadzi do jego ôdciepniyńcio bez RC. Ôd downa sugeruje sie, co zmiany kōnformacyjne ôdegrowajōm rola we wiōnzaniu sie i redukcyji chinōnōw. Zdolność zamrożōnych RC do redukcyje chinōnōw po ćmawyj adaptacyji je zaburzōno (36); Krystalografijo ryntgynowsko pokozuje, iże te szkody wynikajōm z uwiynziynio chinōnōw QB w “dystalnyj” kōnformacyji kole 4,5 Å ôd aktywnego pozycyje proksymalnego (26) , 37). Sugerujymy, iże ta dystalno kōnformacyjo wiōnżōnco je migawkōm stanu postrzednigo miyndzy apolipoproteinym a połnōm strukturōm piestrzyniowym, kery nastympuje po poczōntkowyj interakcyji z chinōnym i ôtwarciu miyjsca QB.
RC zorty II wystympujōncy w kōmpleksie PSII niykerych bakteryjōw fototroficznych i sinicōw, glōnōw i roślin mo zachowanie strukturalne i funkcjōnalne (38). Wyrōwnanie strukturalne pokozane na figurze 6 (D i E) podkryślo podobiyństwo miyndzy RC PSII a miyjscym QB bakteryjnego kōmpleksu RC. To porōwnanie je ôd downa modelym badanio blisko pokrewnych systymōw wiōnzanio i redukcyje chinōnōw. Piyrwyjsze publikacyje sugerowały, iże zmianōm kōnformacyjnym towarziszōm redukcyjo PSII chinonōw (39, 40). Bezto, kej weźnie sie pod uwoga ewolucyjne zachowanie RC, tyn wczasnij niyzaôbserwowany mechanizm łōnczynio może być tyż zastosowany w miyjscu QB PSII RC u tlynowanych roślin fototroficznych.
Szczypy Rps ΔpufW (niyznakowano delecyjo pufW) i PufW-His (C-kōńcowe 10x His-znakowane biōłtko-W eksprymowane z naturalnego locus pufW). palustris CGA009 bōł ôpisany w naszyj piyrwyjszyj robocie (16). Te szczypy i izogyniczny ôjciec dzikij zorty były ôdzyskane z zamrożalnika bez pokrycie niywielgij liczby kōmōrek na PYE (kożde 5 g litra -1) (przechowowane w LB w tymperaturze -80 °C, zawiyrajōnce 50% ( w/v) biōłtka glicerolu, ekstrakt drōżdży i sukcynatu (% sukcynatu) pla.)v agar/w [15]. Plata była inkubowano bez noc we ćmawości w tymperaturze pokojowyj w warōnkach beztlynowych, a potym ôświytlano biołym światłym (~50 μmolm-2 s-1) dostarczōnym ôd żarōwek halogenowych OSRAM 116-W (RS Components, UK) bez 3 do 5 dni, aże ukozała sie pojedynczo kolōnijo. Pojedynczo kolōnijo była użyto do zaszczypiynio 10 ml ôstrzodka M22+ (41) dopołniōnego 0,1% (w/v) kwasami kazamino (dalij ôkryślōnymi za M22). Chowanie chowano w warōnkach niskigo tlynu we ćmawości przi 34°C z wstrzōsaniym przi 180 ôbr/min bez 48 godzin, a potym 70 ml kultury zaszczypiōno w tych samych warōnkach bez 24 godziny. Chowanie pōłtlynowe ô ôbjyntości 1 ml je używane do zaszczypianio 30 ml ôstrzodka M22 we 30 ml uniwerzalnyj przezroczystyj szklanyj butelce ze szrōbōm i naprōmiyniowane ze miynszaniym (~50 μmolm-2 s-1) bez 48 godzin ze pōmocōm sterylnyj magnetycznyj siyły miyszanio. Potym 30 ml kultury było zaszczypiōne kole 1 litrem kultury w tych samych warōnkach, co potym było użyte do zaszczypiynio kole 9 litrōw kultury ôświytlanyj przi ~200 μmolm-2 s-1 bez 72 godziny. Kōmōrki były zebrane bez ôdwirowanie przi 7132 RCF bez 30 minut, resuspendowane w ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i przechowowane w tymperaturze -20°C do czasu potrzeby.
Po rozmrożyniu do resuspendowanych kōmōrek przidować pora kryształōw dezoksyrybōnukleazy I (Merck, Wielgo Brytanijo), lizozymu (Merck, Wielgo Brytanijo) i dwie tabletki inhibitora proteazy holoynzymowyj Roche (Merck, Wielgo Brytanijo). W francuskim kōmōrce ciśniyniowo ô 20 000 psi (Aminco, USA) kōmōrki były zaburzōne 8 do 12 razy. Po usuniyńciu nieprzełōnczōnych kōmōrek i nierozpuszczalnych zaniyczyszczyń bez ôdwirowanie przi 18 500 RCF bez 15 minut przi 4°C, błōna była ôsadzano z pigmyntowanego lizatu bez ôdwirowanie przi 113 000 RCF bez 2 godziny przi 43 000 °C. Ôdciepnōńć rozpuszczalno frakcyjo i zaś zasuspendować farbiōno mymbrana w 100 do 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i hōmogynizować, aże niy bōdzie widzialnych agregatōw. Zawieszōno błōna była inkubowano w 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) zawiyrajōncym 2% (w/v) β-DDM bez 1 godzina we ćmawości w tymperaturze 4°C przi delikatnym miyszaniu. Potym ôdwirować w tymperaturze 70°C, coby rozpuścić 150 000 RCF w tymperaturze 4°C bez 1 godzina, coby usuniynć resztowe niyrozpuszczalne substancyje.
Błōna rozpuszczajōnco ze szczypu ΔpufW była nałożōno na 50 ml kolōny jōnōwōmiynnyj DEAE Sepharose z trzema ôbjyntościami kolōny (CV) bufora wiōnżōncego [20 mM tris-HCl (pH 8,0) zawiyrajōncego 0,03% (w / ob) β-DDM]. Umyć kolōmna dwōma buferami wiōnżōncymi CV, a potym umyć kolōmna dwōma buferami wiōnżōncymi zawiyrajōncymi 50 mM NaCl. Kōmpleks RC-LH116 bōł eluowany lynijowym gradiyntym 150 do 300 mM NaCl (w buforze łōnczōncym) na 1,75 CV, a pozostały kōmpleks łōnczōncy bōł eluowany buforem łōnczōncym zawiyrajōncym 300 mM NaCl na 0,5 CV. Zebrać widmo pochłōnialności ôd 250 do 1000 nm, utrzimać frakcyjo ô stosunku pochłōnialności (A880/A280) srogszym ôd 1 przi 880 do 280 nm, roztworzyć ja dwa razy we buforze wiōnżōncym i zaś użyć tyj samyj procedury na kolōnie DEAE Przi czyszczyniu. Roztworzyć frakcyje ô spōłczynnikach A880/A280 srogszych aniżeli 1,7 i spōłczynnikach A880/A805 srogszych aniżeli 3,0, przekludzić trzeci rōnd jōnōwōmiany i zachować frakcyje ô spōłczynnikach A880/A280 srogszych aniżeli 2,2 i spōłczynnikach A880/A805 srogszych aniżeli 0,0. Czynściowo ôczyszczōny kōmpleks bōł skōncyntrowany do ~2 ml we ôdwirowym filtrze Amicon ô 100 000 masy czōnsteczkowyj (MWCO) (Merck, Wielgo Brytanijo) i załadowany na kolōna wykluczajōnco Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) zawiyrajōncym bufer NaC i m 1,5 CV. Zebrać widma pochłōnianio ułōmka wykluczynio srogości i skōncyntrować widma pochłōnianio ze relacyjami A880/A280 nad 2,4 i relacyjami A880/A805 nad 5,8 do 100 A880, i zaroz użyć je do narychtowanio abo przechowowanio necu krio-TEM Keep at -8°C0.
Błōna rozpuszczajōnco ze szczypu PufW-His była nałożōno na 20 ml kolōny sefarozy HisPrep FF Ni-NTA (20 mM tris-HCl (pH 8,0) zawiyrajōncyj 200 mM NaCl i 0,03% (w/w)) we buforze IMca (GE). v) β-DDM]. Kolōmna była przemywano piyńciōma CV bufora IMAC, a potym piyńciōma CV bufora IMAC zawiyrajōncego 10 mM histydyny. Kōmpleks jōndrowy bōł eluowany z kolōny piyńciōma buferami IMAC zawiyrajōncymi 100 mM histydyny. Frakcyjo zawiyrajōnco kōmpleks RC-LH114-W je kōncyntrowano do ~10 ml we miyszanym zbiorniku wyposażōnym we filtr Amicon 100 000 MWCO (Merck, UK), roztworzōno 20 razy buferym wiōnżōncym, a potym przidowano do 25 ml buforu DEAE do wczasnij. Umyć kolōmna sztyryma buforami łōnczōncymi CV, potym eluować kōmpleks na ôźmiu CV na lynijowym gradiyncie ôd 0 do 100 mM NaCl (w buforze łōnczōncym), a pozostałe sztyry CV zawiyrajōnce 100 mM bufora łōnczōncego Resztkowe kōmpleksy chlobiny A8A20 srogsze aniżeli 2,4 i stosunek A880/A805 srogsze aniżeli 4,6 frakcyjōw były skōncetrowane do ~2 ml we filtrze ôdwirowym Amicon 100 000 MWCO, i wypołniōne 1,5 CV IMAC wczasnij Bufer wyrōwnoważōny Superdex 200 buferym wykluczōnym w 16/600 1,5 CV. Zebrać widma pochłōnianio frakcyji wykluczajōncych srogość i skōncyntrować widma pochłōnianio ze spōłczynnikami A880/A280 nad 2,1 i spōłczynnikami A880/A805 nad 4,6 do 100 A880, co sōm zaroz używane do narychtowanio zamrożōnego necu TEM abo przechowowane do potrzeby -80°C.
Do narychtowanio necu TEM ô niskij tymperaturze użyto zamrożalnika zanurzanego Leica EM GP. Kōmpleks bōł roztworzōny we buforze IMAC do A880 z 50, a potym 5 μl było naładowane na nowo rozładowano świytlōm miedzianno siec pokryto wōnglym QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific, UK). Inkubować nec w tymperaturze 20°C i 60% wilgotności wzglyndnyj bez 30 s, potym wysuchać go bez 3 s, a potym gasnōńć go w ciekłym etanie przi -176°C.
Dane kōmpleksu RC-LH114-W były zaregistrowane na eBIC (Elektroniczne Cyntrum Bioôbrazowanio) (Brytyjske Diamyntowe Źrōdło Światła) ze mikroskopym Titan Krios, co funguje przi napiyńciu prziśpiyszaniu 300 kV, przi nōminalnym powiynkszyniu ynergije Choozy 130 000 ga-2× i Do nagrowanio ôbrazōw w trybie rachowanio do zbiyranio danych użyto Gatan 968 GIF Quantum z detektorym szpic K2. Skalibrowano miara piksela wynosi 1,048 Å, a tympo dawki wynosi 3,83 e-Å-2s-1. Zebrał film w czasie 11 sekund i potajlowoł go na 40 czynści. Użyj pokrytyj wōnglym ôbszaru do pōnownego skupiynio mikroskopu, a potym zebrać trzi filmy na dziura. Cołkościo zebrano było 3130 filmōw, przi wartościach defokusu ôd -1 do -3μm.
Dane dlo kōmpleksu RC-LH116 były zebrane ze użyciym tego samego mikroskopu w Laboratorium Biostruktury Asterbury (Uniwersytet w Leeds, Wielgo Brytanijo). Dane były zebrane w trybie rachowanio ze powiynkszyniym 130 k, a srogość pikselōw była skalibrowano do 1,065 Å z dawkōm 4,6 e-Å-2s-1. Film bōł nagrany w czasie 12 sekund i potajlowany na 48 czynści. Ôgōlnie zebrano 3359 filmōw, przi wartościach defokusu ôd -1 do -3μm.
Cołke przetworzanie danych je przekludzane w rułociōngu Relion 3.0 (42). Użyj Motioncorr 2 (43) do skorygowanio ruchu prōmiyni bez woga dawka, a potym użyj CTFFIND 4.1 (44) do ôkryślynio parametra CTF (funkcyjo przenoszynio kōntrastu). Typowe fotomikrografy po tych poczōntkowych etapach przetworzanio sōm pokozane na figurze 2. S16. Muster autōmatycznego doboru je gynerowany bez rynczne dobōr kole 250 pikselōw ze 1000 tajleczek we 250-pikselowyj rōmce i braku ôdniesiynio dwuwymiarowyj (2D) klasyfikacyje, ôdciepujōnc w tyn spōsōb te klasyfikacyje, co społniajōm skażynie prōbki abo niy majōm żodnych dostrzigalnych cych. Potym przekludzōno autōmatyczno selekcyjo na wszyskich mikrofotografijach, a RC-LH114-W wyniōs 849 359 tajleczek, a kōmpleks RC-LH116 476 547 tajleczek. wszyske ôbrane tajleczki przeszły dwa cykle niyreferencyjnyj klasyfikacyje 2D, a po kożdym przejściu tajleczki, co spotykajōm ôbszar wōnglo, skażynie prōbki, brak ôczywistych cych abo moc nakłodajōnce sie tajleczki, sōm ôdciepowane, co skutkuje użyciym 772 033 (90,9%) i 359,678 partles are3578 Ôdpednio RC-LH114-W i RC-LH116. Poczōntkowy model ôdniesiynio 3D bōł wygynerowany ze użyciym metody stochastycznego ôbniżynio gradientu. Przi użyciu poczōntkowego modelu za ôdniesiynie, ôbrane tajleczki sōm sklasyfikowane na sztyry kategoryje we 3D. Używajōnc modelu w tyj kategoryji za ôdniesiynie, przekludz rafinacyjo 3D na tajleczkach w nojsrogszyj kategoryji, potym użyj poczōntkowego filtra niskoprzepustowego 15Å do pokrycio ôbszaru rozpuszczalnika, przidaj 6 pikselōw miynkich rantōw i post-przetworz pikselōw, coby skorygować funkcyjo transfera gōrnego dektora Gatana K2 Mo. Dlo zbioru danych RC-LH114-W tyn poczōntkowy model bōł zmodyfikowany bez usuniyńcie siylnyj tyngości na krańcach maski (ôdłōnczōnyj ôd tyngości kōmpleksu jōndra w UCSF Chimera). Wytworzōne modele (rozdzielczości RC-LH114-W i RC-LH116 to ôdpednio 3,91 i 4,16 Å) sōm używane za ôdniesiynie do drugij rōndy klasyfikacyje 3D. Używane tajleczki sōm zgrupowane w poczōntkowyj klasze 3D i niy zawiyrajōm mocnyj korelacyje ze sōmsiedztwym. Nakłodanie sie abo brak ôczywistych cych strukturalnych. Po drugij rōndzie klasyfikacyje 3D ôbrano była kategoryjo ô nojwyższyj rozdzielczości [Dlo RC-LH114-W jedna kategoryjo to 377 703 tajleczek (44,5%), dlo RC-LH116 sōm ino dwie kategoryje, kej w sumie sōm 260 752 tajleczek (4%) wyrōwnane. po poczōntkowyj rotacyji z niywielgōm rōżnicōm]. Ôbrane tajleczki sōm nazod ekstrahowane w 400-pikselowyj pudełku i rafinowane bez rafinacyjo 3D. Maska rozpuszczalnika je gynerowano ze użyciym poczōntkowego 15Å niskoprzepustowego filtra, 3-pikselowego rozszerzynio karty i 3-pikselowego miynkij maski. Przi użyciu udoskōnalynio CTF na tajleczka, korekcyjo ruchu na tajleczka i drugo rōnda udoskōnalynio CTF na tajleczka, udoskōnalynie 3D, maskowanie rozpuszczalnika i postprocessing sōm wykōnowane po kożdym kroku, coby dalij udoskōnalić wynikowo tekstura. Przi użyciu wertu ôdciyńcio FSC (spōłczynnika korelacyje powłoki Fouriera) 0,143, rozdzielczości ôstatecznych modelōw RC-LH114-W i RC-LH116 wynoszōm ôdpednio 2,65 i 2,80Å. Krzywo FSC ôstatecznego modelu je pokozano na figurze 2. S17.
wszyske sekwyncyje biōłtek sōm pobrane z UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID Jednoprot: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProtu: O83005); RC-M (PufM; ID UniProtu: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProtu: A0A4Z9); Biōłtko-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) bōł użyty do kōnstruowanio modelu hōmologije RC, co zawiyro sekwyncyje biōłtek RC-L, RC-M i RC-H jak tyż struktura krystaliczno Rba. sferoidy RC było użyte za muster (ID PDB: 5LSE) (46). Użyj norzyńdzia “przipasowanio karty” w Chimerze UCSF, coby przifasować wygenerowany model do karty (47), poprawić struktura biōłtka i kofaktōr [4×BChl a (miano resztōw bibliotyki mōnōmerōw = BCL), 2×BPh a (BPH), jedna abo dwie zorty UQ10 (U10), jedyn niy-herōn i 3,4-dihydroheksakarbōnilcholina (QAK)] użyć Coota (48) do przidanio. Pōniywoż QAK niy ma dostympny w bibliotyce mōnōmerōw, ôn bōł uparametryzowany ze pōmocōm norzyńdzio eLBOW w PHENIX (49).
Dalij stworzōno podjednostka LH1. Na poczōntku autōmatyczne norzyńdzie kōnstrukcyjne w PHENIX (49) było użyte do autōmatycznego kōnstruowanio czynści sekwyncyje LH1 ze użyciym karty jak tyż sekwyncyjōw biōłtek LH1-α i LH1-β za wejście. Wybierz nojbarzij kōmpletno podjednostka LH1, wyodrymbnij ja i załaduj do Coot, ryncznie przidej w nij brakujōnco sekwyncyjo i ryncznie udoskōnal cołko struktura przed przidaniym dwōch BCls a (BCL) i spiriloksantyny (CRT) [podle ôdpednich Rps Tyngość kōmpleksu LH1 i znano. Gatōnki (17)]. Skopiuj cołko podjednostka LH1, a użyj “Docking Map Tool” UCSF Chimera do dokowanio w sōmsiednim niymodelowym przestrzyństwie tyngości LH1, a potym udoskōnal ja w Coot; powtōrz proces, aże wszyske podjednostki LH1 bydōm zmodelowane. W przipadku struktury RC-LH114-W, bez wydobycie niyprzidzielōnyj tyngości w Coot, biōłtko je segmyntowane z pozostałych niybiōłtkowych skłodnikōw na karcie Chimera USCF, a norzyńdzie Autobuild je używane do ustanowiynio poczōntkowego modelu, a pozostałych podjednostek (biōłtko-W) modelowanio. W FYNIKSIE (49). Przidej brakujōnce sekwyncyje do wynikowego modelu w Coot (48), a potym ryncznie udoskōnal cołko podjednostka. Pozostało niyprzidzielōno tyngość pasuje do kōmbinacyje lipidōw (ID bibliotyki mōnōmerōw PDB CDL = CDL, POPC = 6PL i POPG = PGT), detergentu β-DDM (LMT) i czōnsteczek UQ10 (U10). Użyj ôptymalizacyje PHENIX (49) i manualnyj ôptymalizacyje w Coot (48) do usprawniynio kōmpletnego poczōntkowego modelu, podwiela statystyki modelu i wizualno jakość dopasowanio niy mogōm być dalij poprawiōne. Yntlich użyj LocScale (50) do zaôstrzynio lokalnyj karty, a potym przekludz pora inkszych cyklōw modelowanio niyprzidzielōnyj tyngości jak tyż autōmatycznyj i manualnyj ôptymalizacyje.
Ôdpednie peptydy, kofaktory i inksze lipidy i chinōny zadokowane we jejich ôdpednich tyngościach sōm pokozane na figurach 1 i 2. S18 do S23. Statystyczne informacyje ô ôstatecznym modelu sōm pokozane w tabeli S1.
Bodej, że ôkryślōno inakszyj, widma pochłōnianio UV/Vis/NIR były zebrane na spektrofotōmetrze Cary60 (Agilent, USA) w ôdstympach 1 nm ôd 250 nm do 1000 nm i czasie integracyje 0,1 s.
Roztworzyć prōbka we kwarcowyj kuwecie ze 2 mm sztrekōm do A880 z 1 i zebrać widmo pochłōnianio ôd 400 do 1000 nm. Ôkrōngłe widma dichroiczne były zebrane na spektropolarymetrze Jasco 810 (Jasco, Japōnijo) w ôdstympach 1 nm ôd 400 nm do 950 nm przi tympom skanowanio 20 nm min-1.
Spōłczynnik ekstynkcyje molarnyj je ôkryślany bez roztworzynie kōmpleksu jōndra do A880 ô wysokości kole 50. Rotworz ôbjyntość 10 μl w 990 μl buforu wiōnżōncego abo metanolu i zaroz zebraj widmo pochłōnianio, coby zminimalizować degradacyjo BChl. Zawartość BChl w kożdyj prōbce metanolu ôbliczano ze pōmocōm spōłczynnika ekstynkcyje przi 771 nm 54,8 mM-1 cm-1, a spōłczynnik ekstynkcyje bōł ôkryślōny (51). Podzielić zmierzōne stynżynie BChl bez 32 (RC-LH114-W) abo 36 (RC-LH116), coby ôkryślić stynżynie kōmpleksu jōndrowego, co je potym używane do ôkryślynio widma pochłōnianio tyj samyj prōbki zebranyj we spōłczynniku ekstynkcyje we buforze. rōwnolygły. Dlo kożdyj prōbki przekludzōno trzi powtorzane pōmiary, a do ôbliczanio użyto strzednij pochłōnialności maksimum BChl Qy. Spōłczynnik ekstynkcyje RC-LH114-W mierzōny przi 878 nm wynosi 3280±140 mM-1 cm-1, w czasie kej spōłczynnik ekstynkcyje RC-LH116 mierzōny przi 880 nm wynosi 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 było ôkryślōne podle metody w (52). Krōtko godajōnc, HPLC ôpacznyj fazy (RP-HPLC) przekludzōno ze użyciym systymu HPLC Agilent 1200. Rozpuszczać kole 0,02 nmol RC-LH116 abo RC-LH114-W w 50 μl metanolu:chloroformu 50:50 zawiyrajōncego 0,02% (w/v) chloru żelaza i wstrziknōńć wczasnij zrōwnoważōny roztwor Beckmana Coultera Ultrasfera m6 min-1 mm1 40°C w rozpuszczalniku HPLC (80:20 metanol:2-propanol) na kolōnie ô fasōngach ×25 cm. Przekludzać eluacyjo izokratyczno we rozpuszczalniku HPLC do mōnitorowanio pochłōnialności przi 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidy) i 780 nm (BChl) bez 1 godzina. Pik w chrōmatogramie 275 nm po 25,5 minutach bōł zintegrowany, co niy zawiyroł żodnych inkszych wykrywalnych zwiōnzkōw. Zintegrowano pola je używano do ôbliczanio wielości molarnyj UQ10 pobranyj w ôdniesiyniu do krzywyj kalibracyjnyj ôbliczanyj z wstrzikniyńcio czystych standardōw ôd 0 do 5,8 nmol (Figura S14). Kożdo prōbka była analizowano w trzech powtōrzyniach, a zgłoszōny błōnd ôdpado SD strzednij.
Roztwōr zawiyrajōncy kōmpleks RC-LH1 ô maksymalnyj absorpcyji Qy 0,1 bōł stworzōny ze 30 μM redukowanego cytochrōmu c2 serca kōnicznego (Merck, UK) i ôd 0 do 50 μMUQ2 (Merck, UK). Trzi prōbki ô ôbjyntości 1 ml były przigotowane w kożdym stynżyniu UQ2 i inkubowane bez noc we ćmawości w tymperaturze 4°C, coby zapewnić kōmpletno adaptacyjo do ćmawości przed pōmiōrōm. Roztwōr bōł załadowany do modularnego spektrofotōmetra OLIS RSM1000 wyposażōnego we 300 nm flame/500 linijowe neco, 1,24 mm wlotowe, 0,12 mm postrzodkowe i 0,6 mm wylotowe. Filtr przepustowy ô dugości 600 nm je umiyszczōny na wejściu do prōbkowyj fotorułki i ôdniesiyniowyj rułki fotomnożnika, coby wykluczyć światło pobudzanio. Pochłōnialność była mōnitorowano przi 550 nm przi czasie integracyje 0,15 s. Światło pobudzajōnce je ymitowane ôd 880 nm diody LED M880F2 (Dioda Światło) (Thorlabs Ltd., Wielgo Brytanijo) bez kabel włōkno-ôptyczny przi 90% intynsywności bez kōntroler DC2200 (Thorlabs Ltd., Wielgo Brytanijo) i je ymitowane do kōntu zdrzōdła światła 9°0. Prōmiyń mierny je przeciwny ôdzwiyrciedlyniu, coby swrōcić wszelke światło, co przōdzij niy było pochłōniōne ôd prōbki. Monitorować pochłōnialność 10 s przed ôświytlyniym 50 s. Potym pochłōnialność była dalij mōnitorowano bez 60 s we ćmawości, coby ôcynić stopiyń, w jakim chinolol spōntanicznie redukuje cytochrōm c23 + (patrz figura S8 do surowych danych).
Dane były przetworzōne bez przifasowanie lynijowyj tympo zaczōntkowyj w ôbrymbie 0,5 do 10 s (w zoleżności ôd stynżynio UQ2) i ustrzedniynie tympow wszyskich trzech prōbek przi kożdym stynżyniu UQ2. Styngowanie RC-LH1 ôbliczane ze pōmocōm ôdpednigo spōłczynnika ekstynkcyje było użyte do przekształcynio tympa w posiywność katalityczno, przedstawiōne w Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) i przifasowane do modelu Michaelisa-Mentena do ôkryślynio złudnych wertōw Km i Kcat.
W przipadku pōmior przechodnij pochłōnianio prōbka RC-LH1 była roztworzōno do ~2μM we buforze IMAC zawiyrajōncym 50 mM askorbianu sodu (Merck, USA) i 0,4 mM terbutyny (Merck, USA). Kwas askorbinowy je używany za ôfiarowy dowca elektrōnōw, a tert-butaklofen je używany za inhibitōr QB, coby zapewnić, iże głōwny dowca RC ôstowo zredukowany (to znaczy niy fotoutlyniōny) bez cołki proces pōmior. Kole 3 ml prōbki je przidowane do niestandardowyj ôbrotowyj kōmōrki (ô strzednicy kole 0,1 m, 350 ôbr/min) ô dugości ściyżki ôptycznyj 2 mm, coby zapewnić, iże prōbka na ścieżce lasera mo stykajōncy czas na ćmawo adaptacyjo miyndzy impulsami pobudzynio. Użyj ~100-fs impulsōw laserowych do zmocniynio systymu laserowego Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) do pobudzynio prōbki przi 880 nm przi tympom powtorzanio 1 kHz (20 nJ dlo NIR abo 100 nJ dlo Vis). Przed zebraniym danych, wystawić prōbka na światło pobudzajōnce bez kole 30 minut. Ekspozycyjo powoduje inaktywacyjo QA (możliwe, iże zmyńszo QA raz abo dwa razy). Ale proszōm zwrōcić uwoga, iże tyn proces je ôdwrocalny, pōniywoż po dugim ôkresie ćmawyj adaptacyje RC poleku wrōci do aktywności QA. Spektrōmetr Helios (Ultrafast Systems, USA) bōł użyty do pōmiary przechodnich widmōw z czasym ôpōźniynio ôd -10 do 7000 ps. Użyj ôprogramowanio Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) do rozgrupowanio zbiorōw danych, a potym łōnczynio i ustandaryzowanio. Użyj pakietu ôprogramowanio CarpetView (Light Conversion Ltd., Litwa) do użycio połōnczōnego zbioru danych do uzyskanio spektrōw rōżnicowych zwiōnzanych ze rozpadym, abo użyj funkcyje, co ôbyjmuje mocka wykładnikōw z ôdpowiedziōm insztrumyntu, coby pasuować do ewolucyje spektralnyj jednyj dugości wele w OriginLa, USA).
Jak spōmniano powyżyj (53), stworzōno fotosyntytyczny film zawiyrajōncy kōmpleks LH1 bez tak RC, jak i ôbwodowyj antyny LH2. Membrana była roztworzōno we 20 mM tris (pH 8,0), a potym załadowano do kwarcowyj kuwety z 2 mm ôptycznōm sztrekōm. Impuls laserowy ô 30 nJ bōł użyty do pobudzynio prōbki przi 540 nm z czasym ôpōźniynio ôd -10 do 7000 ps. Przetworz zbiōr danych jak ôpisano dlo Rps. pal prōbka.
Błōna była peletowano bez ôdwirowanie przi 150 000 RCF bez 2 godziny przi 4°C, a potym jeji pochłōnialność przi 880 nm była resuspendowano w 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i 200 mM NaCl. Rozpuszczać błōna bez poleku miynszanie w 2% (w/v) β-DDM bez 1 godzina we ćmawości w tymperaturze 4°C. Prōbka była roztworzōno we 100 mM wōnglanie trietylamōniu (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) do stynżynio biōłtka 2,5 mg ml-1 (analiza Bio-Rad). Dalszy przetworzanie przekludzōno ze wczasnij ôpublikowanyj metody (54), zaczynajōnc ôd roztworzynio 50 μg biōłtka do cołkości 50 μl TEAB zawiyrajōncego 1% (w/v) lauranu sodu (Merck, UK). Po ultrasōnowym ôbsudzeniu bez 60 s, ôna była zredukowano 5 mM tris(2-karboksyetyl)fosfinōm (Merck, UK) w tymperaturze 37°C bez 30 minut. W przipadku S-alkilacyje prōbka inkubować ze 10 mM metylu S-metyltiometansulfōnianym (Merck, UK) i przidować ja z 200 mM roztworu zasobnego izopropanolu bez 10 minut w tymperaturze pokojowyj. Trowiynie proteolityczne przekludzano bez przidanie 2 μg miszōngu trypsyny/yndoproteinazy Lys-C (Promega UK) i inkubowanie w tymperaturze 37°C bez 3 godziny. Lauratu powiyrchniowo czynno była ekstrahowano bez przidowanie 50 μl octanu etylu i 10 μl 10% (ôb/ôb) kwasu trifluorooctowego klasy LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) i wirowanie bez 60 s. Rozdzielynie faz było prōmowane bez ôdwirowanie przi 15 700 RCF bez 5 minut. Podle protokołu producenta, spinowo kolōmna C18 (Thermo Fisher Scientific, Wielgo Brytanijo) była użyto do ôstrōżnego aspirowanio i ôdsolynio spodnij fazy zawiyrajōncyj peptyd. Po wyschniyńciu bez prōzniowo ôdwirowanie prōbka była rozpuszczōno we 0,5% TFA i 3% acetōnitrilu, a 500 ng było analizowane ze pōmocōm nanoprzepływowyj chrōmatografije RP w połōnczyniu ze spektrōmetryjōm masowōm ze użyciym parametrōw systymu szczegōłowo ôpisanych wczasnij.
Użyj MaxQuant v.1.5.3.30 (56) do idyntyfikacyje i kwantyfikacyje biōłtek do poszukowanio Rps. baza danych proteōmōw palustris (www. Dane proteōmiki spektrōmetryje masowyj były słożōne we Sojuszu ProteomeXchange bez repozytorium partnerski PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pod idyntyfikatorym zbioru danych PXD020402.
Do analizy ze pōmocōm RPLC w połōnczyniu ze spektrōmetryjōm masowōm jōnizacyje elektrospray, kōmpleks RC-LH1 bōł stworzōny z Rps dzikij zorty. Przi użyciu wczasnij ôpublikowanyj metody (16), stynżynie biōłtka produkowanego w kōmōrkach palustrisa wyniosło 2 mg ml-1 w 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl i 0,03% (w/v) β- (analiza Bio-Rad) ) DDM. Podle protokołu producenta, użyj zestawu czyszczynio 2D (GE Healthcare, USA) do wydobycio 10 μg biōłtka metodōm ôdpadniyńcio, i rozpuszczaj ôsad w 20 μl 60% (v / v) kwasu mrzōnkowego (FA), 20% (v / v) acetōnitrilu/ 20% (v) wody. Piynć mikrolitrōw było przeanalizowanych ze pōmocōm RPLC (Dionex RSLC) w połōnczyniu ze spektrōmetryjōm masowōm (Maxis UHR-TOF, Bruker). Użyj kolōny MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Wielgo Brytanijo) do separacyje przi 60°C i 100 μlmin -1, z gradiyntym 85% (v / v) rozpuszczalnika A [0,1% (v / v) FA i 0,02% (v / v) roztwōr B8/v a [0,1%(v/v) FA i 0,02%(v/v) w 90%(v/v) acetōnitrilu TFA] Przi użyciu sztandardowego zdrzōdła jōnizacyje elektrospray i parametrōw domyślnych bez wiyncyj jak 60 minut, spektrōmetr masowy dostowo ôd 100 do 2750 m/z (stosunek masy do ładunku). Społym ze pōmocōm norzyńdzio FindPept portalu zasobōw bioinformatyki ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapuj widmo mas do podjednostek kōmpleksu.
Kōmōrki chowano bez 72 godziny pod 100 ml światła niskigo (10 μMm-2 s-1), postrzednigo (30 μMm-2 s-1) abo wysokigo (300 μMm-2 s-1). Ôstrzodek M22 (ôstrzodek M22, w kerym siarczan amōniu je pōminiynty, a sukcynian sodu je zastōmpiōny octanym sodu) we 100 ml butelce ze śrubōm (23). W piyńciu cyklach 30-sekundowych szklane koraliki ô ôbjyntości 0,1 mikronu były koralikane we stosunku ôbjyntości 1:1, coby lizować kōmōrki i ôchłodzane na lodzie bez 5 minut. Niyrozpuszczalno materyjo, nieprzełōmane kōmōrki i szklane koraliki były usuniynte bez ôdwirowanie przi 16 000 RCF bez 10 minut we ławowyj mikrocyntryfudze. Błōna była rozdzielano we rotorze Ti 70.1 z 100 000 RCF w 20 mM tris-HCl (pH 8,0) z gradiyntym sacharozy 40/15% (w/w) bez 10 godzin.
Jak ôpisano w naszyj piyrwyjszyj robocie, immunodetekcyjo His tag na PufW (16). Krōtko godajōnc, ôczyszczōny kōmpleks jōndrowy (11,8 nM) abo mymbrana zawiyrajōnco to samo stynżynie RC (ôkryślōne bez utlyniynie ôdyjmujōnce zredukowane widma rōżnice i sztimujōnce ôbciynżynie na farbiōnym żelu) w 2x buforze ôbciōngajōncym SDS (Merck, UK) roztworzōne dwa razy. Biōłtka były rozdzielane na repliki 12% bis-trisowego żelu NuPage (Thermo Fisher Scientific, Wielgo Brytanijo). Żel bōł farbiōny błynkitnym modrym Coomassie (Bio-Rad, Wielgo Brytanijo) do załadowanio i wizualizacyje podjednostki RC-L. Biōłtko na drugim żelu było przeniesiōne na błōna z fluorym poliwinilidynu aktywowanym ôd metanolu (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Wielgo Brytanijo) do immunotestu. Błōna PVDF była zablokowano w 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 i 5% (b/v) ôdtłuszczōnego mlyka w proszku, a potym inkubowano z piyrwotnym przeciwciałym anty-His (w buforze mHC-5l 7,6), 150 mM NaCl i 0,05% (ôb/ôb) Tween-20] w 1:1000 A190-114A, Laboratorium Betylu, USA) bez 4 godziny. Po myciu 3 razy bez 5 minut w buforze przeciwciał, błōna była połōnczōno ze mysiym wtōrnym przeciwtŏłym przeciwko peroksydazie chrōnu (Sigma-Aldrich, UK) (roztworzōnym 1:10 000 we buforze przeciwciałowym) W inkubacyjo, coby dozwolić wykrycie (5 minut po 3 myciach we buforze przeciwciała EESTAR0). (Sianagyn, Italijo) i Amersham Imager 600 (Ôpieka Zdrowotowo GE, Wielgo Brytanijo).
Bez narysowanie dystrybucyje intynsywności kożdego farbiōnego żelu abo ôsi immunotestu, integracyjo ôbszaru pod szpicym i ôbliczanie stosunku intynsywności RC-L (farbiōny żel) i Protein-W (immunotest), w ImageJ (57) Przetworz ôbraz. Te relacyje były przekształcōne we relacyje molarne bez zakłodanie, iże stosunek RC-L do biōłtka-W w czystyj prōbce RC-LH114-W bōł 1:1 i ôdpednio normalizowanie cołkigo zbioru danych.
Coby zapoznać sie z ekstra materyjami do tego artykułu, patrz http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
Je to artykuł z ôtwartym dostympym rozpowszechniany na warōnkach Licyncyje Atrybucyje Creative Commons. Tyn artykuł przizwolo na niyôgraniczōne użycie, dystrybucyjo i reprodukcyjo we leda jakim medium pod warōnkym, iże ôryginalne dzieło je akuratnie cytowane.
Napomniynie: Prosimy ino ô podanie twojigo adresu e-mail, coby ôsoba, kerõ rekōmyndujesz na strōna, wiedziała, iże chcesz, coby zoboczyła e-mail i że to niyma spam. Niy chwytamy żodnych adresōw e-mail.
To pytanie je używane do przetestowanio, eli jesteś gościym i do zapobiyganio autōmatycznymu przesyłaniu spamu.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jacksōn, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompsōn, Neil A. Ransōn, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Andrew Hirmaco
Struktura we wysokij rozdzielczości kōmpleksu light trap 1 w cyntrum reakcyje dostarczo nowych wglōndōw na dynamika chinōnōw.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jacksōn, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompsōn, Neil A. Ransōn, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Andrew Hirmaco
Struktura we wysokij rozdzielczości kōmpleksu light trap 1 w cyntrum reakcyje dostarczo nowych wglōndōw na dynamika chinōnōw.
©2021 Amerykański Stowarziszynie dlo Postympu Nauki. wszyske prawa zastrzeżōne. AAAS je partnyrym ôd HINARI, AGORI, OARE, CHORU, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. Postympy Nauki ISSN 2375-2548.